缺血性中風(fēng)對老年人是一個重大危險。干預(yù)措施只能用于清除血栓，缺血性中風(fēng)期間神經(jīng)元死亡的機(jī)制仍存在爭議。鐵死亡是各種器官缺血后細(xì)胞死亡的一種機(jī)制。我們報道了絲氨酸蛋白酶，凝血酶，通過促進(jìn)花生四烯酸的動員和隨后的鐵性基因，acyl-CoA合成酶長鏈家族成員4 (ACSL4)的酯化來激發(fā)鐵性信號傳遞。一種無偏多組學(xué)方法確定了凝血酶和ACSL4基因/蛋白質(zhì)，以及它們的前鐵毒phosphatidyl ethanolamine脂質(zhì)產(chǎn)物，在嚙齒動物大腦中動脈閉塞時顯著改變。在基因或藥理學(xué)上抑制該途徑中的多個點(diǎn)，可減弱體外和體內(nèi)缺血模型的結(jié)果。因此，凝血酶-ACSL4軸可能是改善缺血性腦卒中鐵性神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。本文于2022年2月發(fā)表于Signal Transduction and Targeted Therapy (IF= 39.3)。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
(1) 急性腦I/R后凝血酶上調(diào)
       由鐵死亡引起的細(xì)胞死亡是由于有毒的脂質(zhì)氫過氧化物積累超過細(xì)胞解毒的能力。含有phosphatidyl ethanolamine(PEs)的花生四烯酸(AA)特別容易發(fā)生鐵中毒過氧化反應(yīng)。通過對小鼠缺血性中風(fēng)后海馬組織進(jìn)行高質(zhì)量的非靶向代謝組學(xué)分析(圖1a)，我們發(fā)現(xiàn)了四種磷脂顯著降低，即PC(36:4)、PE(42:8)、PE (38: 6p)和PE(40:7)(圖1b-h)。進(jìn)一步分析其脂肪酸側(cè)鏈，發(fā)現(xiàn)PC(36:4, 16:0/20:4)、PE(42:8, 22:4/20:4)、PE (38:6p, 18:2p/20:4)脂肪酸側(cè)鏈中均含有AA(圖1i)，且AA(20:4)占主導(dǎo)地位(圖1j)，這與小鼠缺血性腦卒中后海馬組織游離AA顯著增加(腦卒中/對照比=1.49, p=0.0007，圖1k)一致。
       為了探索缺血性卒中后AA升高的蛋白，我們對同一組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析(圖2a-c)。基于差異表達(dá)蛋白的富集，血小板激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和聚集是上調(diào)最多的通路(圖2d, e)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析也一致指出了相同的途徑(圖2f)，凝血酶原(F2基因編碼凝血酶原，也稱為凝血因子II)，凝血酶酶原是上調(diào)最多的蛋白質(zhì)(圖2g)，western blotting進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖2h)。

圖1：在缺血/再灌注后，磷脂側(cè)鏈上的花生四烯酸被釋放

圖2：急性腦缺血/再灌注后凝血酶上調(diào)

(2) 凝血酶誘導(dǎo)鐵死亡獨(dú)立于鐵積累
       凝血酶是缺血性中風(fēng)的主要藥物靶點(diǎn)之一，其作用是促進(jìn)纖維蛋白的產(chǎn)生和凝血。凝血酶可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)凝血酶劑量依賴性誘導(dǎo)N27神經(jīng)元細(xì)胞死亡(圖3a)，并伴有AA升高(圖3b)和脂質(zhì)氫過氧化物升高(圖3c, d)，線粒體變小，膜密度增加(圖3e)，這些特征都與鐵死亡一致。凝血酶不影響細(xì)胞內(nèi)亞鐵的水平，這不是誘導(dǎo)鐵死亡的必要條件(圖3f)。更重要的是，凝血酶誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡可以通過鐵死亡抑制劑liproxstatin-1(圖3g)和谷胱甘肽前體N-acetyl-L-cysteine (圖3h)和cPLA2α抑制劑darapladib(圖3i)的治療來阻止。liproxstatin-1同樣可以防止MDA-MB-231細(xì)胞(一種人類乳腺癌細(xì)胞系)的細(xì)胞死亡，這表明了凝血酶在腦外鐵死亡中的作用(圖3j, k)。
       凝血酶作為一種絲氨酸蛋白酶，自發(fā)地激活cPLA2α，它在甘油磷脂的sn-2位置切割A(yù)A,導(dǎo)致AA從膜上釋放。我們的數(shù)據(jù)表明，凝血酶升高是缺血性中風(fēng)后AA動員的上游信號，這會導(dǎo)致鐵死亡。我們發(fā)現(xiàn)達(dá)比加群在N27神經(jīng)元培養(yǎng)的I/R氧-葡萄糖剝奪(OGD)模型中保護(hù)細(xì)胞，神經(jīng)癥狀緩解和減少腦梗死體積(補(bǔ)充圖未展示)。由于OGD和MCAO模型都不涉及可能與凝血酶抑制有關(guān)的血栓形成，這些發(fā)現(xiàn)表明凝血酶誘導(dǎo)的另一種損傷被達(dá)比加群阻斷。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了凝血酶誘導(dǎo)鐵死亡的可能性，這可能與缺血性中風(fēng)有關(guān)。

圖3：凝血酶誘導(dǎo)神經(jīng)元鐵死亡

(3)氧依賴性鐵死亡發(fā)生在腦I/R損傷
       為了證實(shí)缺血性中風(fēng)中鐵死亡的發(fā)生，我們調(diào)整了MCAO/R的條件，并研究了其生化和行為變化。小鼠和大鼠在MCAO/R后(再灌注后24小時)，與對側(cè)“對照”半球相比，同側(cè)“卒中”半球受影響的海馬和皮層區(qū)域的脂質(zhì)過氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)(脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物)水平顯著升高(小鼠：圖4a, b；大鼠：補(bǔ)充圖未展示)。透射電鏡(TEM)圖像顯示，MCAO/R后24 h同側(cè)皮層區(qū)域的這些特征伴有神經(jīng)元線粒體收縮，鐵脫鐵特征(補(bǔ)充圖未展示)。
       在MCAO/R后立即給藥的亞毒性劑量RSL3 (GPx4抑制劑)和erastin (Xc^?抑制劑) 增強(qiáng)鐵性傾向，顯著加重小鼠腦I/R損傷，表現(xiàn)為MDA水平顯著升高(圖4c)，神經(jīng)行為缺陷(圖4d)，梗死體積增加(MCAO/R后24小時；圖4e)。脂基捕獲劑和原型鐵死亡抑制劑liproxstatin-1和ferrostatin-1可有效減弱MCAO小鼠模型中的腦I/R損傷。然而，這些抑制劑不能挽救MCAO(即無再灌注)造成的神經(jīng)元損傷(圖4f, g)，因?yàn)殍F死亡依賴于氧氣，進(jìn)一步表明鐵死亡可能發(fā)生在再灌注階段。
       我們在I/R的氧葡萄糖剝奪(OGD)細(xì)胞培養(yǎng)模型中證實(shí)了神經(jīng)元鐵死亡的發(fā)生。N27神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)OGD處理2小時(圖4h)死亡前，細(xì)胞內(nèi)Fe²⁺水平升高(圖4i)，脂質(zhì)過氧化物(圖4j, k)，脂質(zhì)氫過氧化物，以及細(xì)胞內(nèi)總ROS和MDA(補(bǔ)充圖未展示)。與對照細(xì)胞相比，OGD處理的N27細(xì)胞中的線粒體也顯著變小，但膜密度增加(補(bǔ)充圖未展示)。Liproxstatin-1治療挽救了OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡(圖1l)，顯示了鐵死亡的參與。

圖4：腦再灌注損傷的氧依賴性鐵死亡

(4) 缺血性中風(fēng)后血小板活化
       凝血功能的激活是缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷的主要原因。抑制凝血酶有可能預(yù)防和治療腦梗死，并降低腦卒中后殘余神經(jīng)功能缺損的程度。凝血酶抑制劑的臨床試驗(yàn)是基于其抗凝血作用進(jìn)行的。然而，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中的凝血酶也可以通過其絲氨酸蛋白酶活性引發(fā)鐵死亡。這種凝血酶升高的來源值得研究。為了研究缺血性腦卒中期間凝血系統(tǒng)的變化，我們收集了59份血清樣本，包括27例健康對照組和32例缺血性腦卒中患者，在去除血清中高豐度蛋白后，進(jìn)行TMT標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)分析(圖5a-e)。84.7%的樣本相關(guān)值大于0.98，相關(guān)值范圍在0.968-0.993之間(圖5a)，表明結(jié)果具有可重復(fù)性。在分析中，我們總共鑒定出584個蛋白質(zhì)，其中424個蛋白質(zhì)可以得到≥2個多肽的支持，平均數(shù)量為8.31個(圖5c)。評估了不同樣本中蛋白質(zhì)的分布，我們發(fā)現(xiàn)超過50%的樣本中有362種蛋白質(zhì)被定量(圖5d)?；诎?62個蛋白質(zhì)的隨機(jī)森林估算數(shù)據(jù)的tSNE分析驗(yàn)證了不存在批效應(yīng)(圖5e)。
       我們在缺血性卒中血清中共鑒定出28個蛋白上調(diào)，21個蛋白下調(diào)(圖5f)。其中，缺血性腦卒中患者血清中纖維蛋白凝塊形成明顯上調(diào)(圖5g-k)，這與小鼠大腦中血小板聚集增加一致(圖2f)。然而，與健康對照組相比，血清中凝血酶水平?jīng)]有明顯升高(圖5l)，這表明我們在大腦中觀察到的升高(圖2h)可能不是來自血液。因此，如果達(dá)比加群具有缺血性卒中后的神經(jīng)保護(hù)作用(補(bǔ)充圖未展示)，其有益作用不太可能來自于其在血液中的抑制凝血活性。相反，缺血性中風(fēng)患者血液中凝血酶沒有升高，這表明抗凝血酶藥物的任何益處都可能是由于大腦中凝血酶的升高(圖2h)?？紤]到凝血酶在調(diào)動強(qiáng)鐵脂肪酸AA方面的額外作用，我們假設(shè)凝血酶可能會誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)后的鐵死亡。

圖5：缺血性中風(fēng)后血小板活化

(5) ACSL4介導(dǎo)凝血酶神經(jīng)毒性
       Acyl-CoA合成酶長鏈家族成員4 (ACSL4)是一種重要的脂質(zhì)代謝酶，通過將游離AA轉(zhuǎn)化為花生四烯醛-CoA生成脂質(zhì)氫過氧化物來參與鐵死亡。與游離AA通過促進(jìn)其泛素化和蛋白酶體降解抑制ACSL4水平一致，凝血酶處理后N27細(xì)胞中的ACSL4降低(圖6a)，而不影響ACSL4 mRNA的表達(dá)(補(bǔ)充圖未展示)。I/R后6 h，缺血區(qū)海馬區(qū)ACSL4蛋白表達(dá)明顯下降，而ACSL4 mRNA表達(dá)在同一時間點(diǎn)無明顯變化(補(bǔ)充圖未展示)。由于缺血性卒中后小鼠海馬區(qū)游離AA顯著增加(圖1k)，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，在I/R過程中ACSL4的降低可能是翻譯后修飾的結(jié)果。通過western blot(圖6b)或組織學(xué)(圖6c)檢測，我們還發(fā)現(xiàn)MCAO/R后大鼠同側(cè)海馬ACSL4的表達(dá)隨著時間的推移相似地下降。在i/R后3小時，ACLS4明顯減少，這是在i/R后6小時開始海馬神經(jīng)元損失之前(圖6d, e)。大鼠的結(jié)果與MCAO后小鼠的結(jié)果一致(補(bǔ)充圖未展示)。然而，凝血酶在缺血早期明顯升高(圖6f)。這些數(shù)據(jù)表明，ACSL4下調(diào)是腦I/R的早期事件，獨(dú)立于神經(jīng)元死亡而發(fā)生，這可能是對凝血酶誘導(dǎo)應(yīng)激的保護(hù)性反應(yīng)。
       為了闡明凝血酶細(xì)胞毒性是否由ACSL4介導(dǎo)，我們使用基于CRISPR-Cas9的基因編輯生成了ACSL4敲除(KO) N27細(xì)胞，使用含有ACSL4表達(dá)框的慢病毒載體pLenti-OE-rACSL4生成了ACSL4過表達(dá)(OE)細(xì)胞。western blotting證實(shí)了這兩種調(diào)制(圖6g，上圖)。我們發(fā)現(xiàn)凝血酶依賴于ACSL4引起毒性，因?yàn)槟傅募?xì)胞毒性因ACSL4的還原而恢復(fù)，并因ACSL4的過表達(dá)而加重(圖6g)。ACSL4抑制劑吡格列酮(PIO)也能阻斷凝血酶的細(xì)胞毒性(補(bǔ)充圖未展示)。這些結(jié)果表明，凝血酶可能通過促進(jìn)ACSL4依賴的鐵死亡而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，而ACSL4的降低可能有助于抑制凝血酶引起的鐵死亡損傷。

圖6：凝血酶誘導(dǎo)急性腦缺血/再灌注后ACSL4下調(diào)

(6) 調(diào)節(jié)ACSL4表達(dá)改變急性缺血性腦損傷的結(jié)局
       為了確定ACSL4是否影響腦I/R后的預(yù)后，我們通過單次注射腺相關(guān)病毒載體，即AAV8-mACSL4(過表達(dá)，OE)和AAV8-EF-Cas9+AAV8-mACSL4-sp.g3(敲除，KO)，在小鼠左海馬CA3區(qū)域(小鼠對MCAO/R最脆弱的區(qū)域)選擇性過表達(dá)或敲除Acsl4，并檢查了MCAO嚙齒動物模型的影響(圖7a)。以AAV8-EGFP(綠色熒光蛋白增強(qiáng)型AAV8)為對照。免疫熒光染色證實(shí)了轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效性(圖7b)。與EGFP小鼠相比，再灌注后5天，在相同的30分鐘MCAO/R條件下，ACSL4 OE小鼠表現(xiàn)出明顯的梗死體積增加(灌注后24小時，圖7c)，神經(jīng)評分惡化(圖7d)，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動性能變差(圖7e)。相比之下，與EGFP小鼠相比，ACSL4 KO小鼠對I/R損傷有保護(hù)作用，梗死體積減小(圖7f)，神經(jīng)評分(圖7g)和運(yùn)動協(xié)調(diào)性(圖7h)也有顯著改善。與鐵死亡抑制劑一致，ACSL4 KO小鼠MCAO后神經(jīng)元損傷與對照小鼠無差異(圖7i, j)，這強(qiáng)烈提示在該模型中，鐵死亡發(fā)生在再灌注期間。
       這些在小鼠中的結(jié)果在大鼠中得到了復(fù)制，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)性中風(fēng)研究的一個主要問題是動物模型的可重復(fù)性。激光散斑信號顯示敲除ACSL4對MCAO/R后大鼠皮層血流無影響(圖7k, l)，證實(shí)ACSL4 KO不是單純通過影響血流動力學(xué)而起到保護(hù)作用。AAV輔助ACSL4敲除大鼠皮層對I/R誘導(dǎo)的功能損傷具有顯著保護(hù)作用(神經(jīng)評分；圖7m)和腦梗死體積(TTC染色；圖7 n)。
       我們發(fā)現(xiàn)ACSL4 KO細(xì)胞對RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡有保護(hù)作用，而ACSL4 OE細(xì)胞對同樣的毒素脆弱(補(bǔ)充圖未展示)。然后我們將這些細(xì)胞進(jìn)行OGD/再氧化，發(fā)現(xiàn)ACSL4 KO細(xì)胞對OGD相關(guān)毒性具有抗性，而ACSL4 OE細(xì)胞更容易受到OGD相關(guān)毒性的影響(補(bǔ)充圖未展示)。使用triacsin C或PIO對ACSL4進(jìn)行藥物抑制，可預(yù)防I/R損傷，神經(jīng)評分顯著改善和灌注后24小時梗死體積減少證明了這一點(diǎn)(補(bǔ)充圖未展示)。在正常的N27細(xì)胞中，PIO也被發(fā)現(xiàn)能在體外預(yù)防OGD，但對ACSL4 KO細(xì)胞(補(bǔ)充圖未展示)沒有作用。

圖7：調(diào)節(jié)ACSL4表達(dá)改變急性缺血性腦損傷的結(jié)局

結(jié)論
       抗凝血酶療法可能通過抑制鐵死亡而對中風(fēng)再灌注后有益，也可能對涉及鐵死亡的其他疾病有用。

圖8：原理的假設(shè)

實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞活力測定，局灶性腦缺血模型，旋轉(zhuǎn)跑步機(jī)試驗(yàn)，梗死體積分析，小鼠花生四烯酸的檢測，細(xì)胞死亡測量，免疫熒光，蛋白質(zhì)組學(xué)LC-MS/MS分析，脂質(zhì)組學(xué)LC-MS/MS分析，脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)搜索
參考文獻(xiàn)
Tuo, Q. Z., Liu, Y., Xiang, Z., Yan, H. F., Zou, T., Shu, Y., Ding, X. L., Zou, J. J., Xu, S., Tang, F., Gong, Y. Q., Li, X. L., Guo, Y. J., Zheng, Z. Y., Deng, A. P., Yang, Z. Z., Li, W. J., Zhang, S. T., Ayton, S., Bush, A. I., … Lei, P. (2022). Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal transduction and targeted therapy, 7(1), 59. https://doi.org/10.1038/s41392-022-00917-z.

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