口服二羥苯丙氨酸(多巴)補(bǔ)充神經(jīng)元多巴胺仍然是帕金森病(PD)最有效的治療方法。然而,與正常神經(jīng)元持續(xù)穩(wěn)定的多巴胺信號不同,口服多巴引起血漿多巴水平劇烈波動,導(dǎo)致多巴誘導(dǎo)的運(yùn)動障礙。在此,作者報(bào)道了一種基于功能核酸的響應(yīng)性人工酶(FNA-Fe3O4)用于原位連續(xù)生產(chǎn)Dopa。FNA-Fe3O4可以跨越血腦屏障,依靠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體適配體靶向病變神經(jīng)元。然后,F(xiàn)NA-Fe3O4響應(yīng)病變神經(jīng)元中過表達(dá)的α -突觸核蛋白mRNA進(jìn)行反義寡核苷酸處理和熒光成像,同時(shí)轉(zhuǎn)換為模擬酪氨酸羥化酶的酪氨酸適配體人工酶(Apt-Fe3O4)用于原位連續(xù)生產(chǎn)多巴。體內(nèi)FNA-Fe3O4治療導(dǎo)致PD小鼠模型中Dopa和多巴胺水平恢復(fù),病理性過表達(dá)的α -突觸核蛋白減少,從而改善運(yùn)動癥狀和記憶缺陷。本文提出的基于功能核酸的響應(yīng)性人工酶策略為PD的診斷和治療提供了一種更神經(jīng)元友好的方法。本研究于2023年5月發(fā)表于期刊《Nature Communications》上,IF:16.6。
技術(shù)路線:
主要研究結(jié)果:
在本研究中,作者首先詳細(xì)解釋了Fe3O4納米粒子在過氧化氫(H2O2)和抗壞血酸(AA)存在的情況下,對酪氨酸羥基化產(chǎn)生多巴(圖1a,Phase I)。進(jìn)一步構(gòu)建了基于酪氨酸適配體的人工酶(Apt-Fe3O4),其中Fe3O4作為催化活性中心,酪氨酸適配體29作為底物結(jié)合位點(diǎn)(圖1a,Phase II)。在病變神經(jīng)元中,F(xiàn)NA-Fe3O4被轉(zhuǎn)化為Apt-Fe3O4以響應(yīng)高水平的SNCA mRNA,從而表現(xiàn)出類似于Dopa產(chǎn)生的酪氨酸羥化酶活性(圖1a,Phase III)。
圖1
1、Fe3O4介導(dǎo)的酪氨酸羥基化
Fe3O4納米顆粒先前被報(bào)道可以催化酪氨酸的多步氧化,通過中間產(chǎn)物多巴(Dopa)生成最終產(chǎn)物多巴色素。然而,中間產(chǎn)品Dopa形成的詳細(xì)機(jī)制尚未得到解釋。因此,作者探究中間產(chǎn)物Dopa的穩(wěn)定存在,以及在病理濃度的AA和H2O2存在下Fe3O4催化酪氨酸羥基化生成Dopa的過程。以市售15 nm水分散表面羧基修飾的Fe3O4納米粒子為模型,考察其催化酪氨酸羥基化合成多巴的性能。圖2a顯示了在10 μg mL-1 Fe3O4、5 mM H2O2和5 mM AA存在下,100 μM酪氨酸羥化轉(zhuǎn)變成多巴過程中的含量變化。反應(yīng)混合物中的每個(gè)組分都是驅(qū)動酪氨酸羥基化為多巴所必需的(圖2b)。根據(jù)這些組分的反應(yīng)活性,可能存在多種活性自由基中間體。tert-Butanol傾向于主要淬滅·OH,而乙醇能有效清除·OH和Fe(IV)=O39。反應(yīng)體系中tert-Butanol的加入在5 min后輕度抑制了反應(yīng)39.4 %,而乙醇的加入誘導(dǎo)了更嚴(yán)重的抑制60.4 %(圖2c)。這些差異可歸因于羥基化過程中·OH和高自旋Fe(IV)=O的參與。
為進(jìn)一步了解Fe3O4在H2O2和AA存在下催化酪氨酸羥基化生成Dopa的機(jī)理,作者進(jìn)行了一系列電子自旋共振(ESR)實(shí)驗(yàn),并將這些結(jié)果與反應(yīng)的活性中間體進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。圖2d顯示了Fe3O4與H2O2共存的混合體系中明顯的羥基自由基(·OH)信號,這與Fe3O4納米酶40固有的過氧化物酶活性一致。圖2e表明,F(xiàn)e3O4與AA共存時(shí),沒有檢測到自由基的產(chǎn)生。而在Fe3O4、H2O2和AA存在下,觀察到新的自由基信號為過氧自由基(·OOH),并且伴隨著體系中·OH的完全消失(圖2f)。H2O2與AA之間沒有發(fā)生直接的自由基反應(yīng)(圖2g)。這些結(jié)果表明AA是·OOH形成的關(guān)鍵促進(jìn)劑并導(dǎo)致·OH耗竭。進(jìn)一步地,在·OOH的混合體系中加入酪氨酸底物后,·OOH的強(qiáng)度降低,自由基種類沒有發(fā)生變化(圖2h),暗示·OOH為酪氨酸向多巴的轉(zhuǎn)化提供了關(guān)鍵物種。據(jù)報(bào)道,·OOH與Fe2+結(jié)合生成高自旋Fe(IV)= O中間體41,其結(jié)構(gòu)與生物蛋白酪氨酸羥化酶的活性中心相似。以二甲基亞砜(DMSO)作為Fe(IV)=O的探針,通過氧原子轉(zhuǎn)移與Fe(IV)= O反應(yīng)生成二甲基砜(MSM)。根據(jù)圖2i的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析結(jié)果,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,MSM的峰逐漸增強(qiáng),表明可能發(fā)生了Fe(IV)= O。這些結(jié)果為酪氨酸羥基化的機(jī)理路徑提供了有效的解釋(圖2j)。Fe3O4與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生的·OH在AA的催化作用下轉(zhuǎn)化為·OOH。然后·OOH介導(dǎo)生成活性中間體Fe(IV)=O,最后羥基化酪氨酸生成多巴。
圖2 Fe3O4納米顆粒的酪氨酸羥化酶模擬活性
2、Apt-Fe3O4的結(jié)構(gòu)與表征
適體結(jié)合位點(diǎn)與納米酶的共價(jià)連接被引入作為一種通用的方法,通過將反應(yīng)底物集中在催化納米酶核心上來提高納米酶的催化活性,從而模擬天然酶的結(jié)合和催化活性位點(diǎn)功能(圖3a)。在確定Fe3O4納米酶的酪氨酸羥化酶模擬活性后,通過EDC/NHS介導(dǎo)的酰胺縮合反應(yīng)將Fe3O4納米酶與5 '端氨基修飾的酪氨酸適體共價(jià)偶聯(lián),構(gòu)建基于酪氨酸適體的人工酶Apt-Fe3O4。作者還制備了隨機(jī)序列DNA偶聯(lián)的Fe3O4(Ran-Fe3O4)用于對比。
作者考察不同濃度的酪氨酸(所有實(shí)驗(yàn)均使用5 mM H2O2和5 mM AA)在Fe3O4、Ran-Fe3O4和Apt-Fe3O4(10 μg mL-1)的催化作用下,酪氨酸羥化生成多巴的速率隨酪氨酸濃度的變化,如圖3b的動力學(xué)曲線所示。對于Apt-Fe3O4或?qū)φ眨^察到Michaelis-Menten-type saturation kinetic曲線。與純Fe3O4相比,Ran-Fe3O4的催化活性幾乎相同,而Apt-Fe3O4的催化活性顯著提高。Apt-Fe3O4催化活性的增強(qiáng)歸因于靠近催化界面的底物的高局部濃度,這是由于適配體與酪氨酸底物的特異性結(jié)合。
值得注意的是,水溶液作為最簡單的模型,無法模擬實(shí)際的細(xì)胞內(nèi)大分子擁擠環(huán)境。因此,在以20 wt % PEG-20000作為擁擠劑的模擬擁擠環(huán)境中評估了Apt-Fe3O4和對照的催化能力。如圖3c所示,與水溶液中的催化速率相比,F(xiàn)e3O4和Ran-Fe3O4的催化速率明顯下降,表明它們的催化功能在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中受到嚴(yán)重干擾。然而,Apt-Fe3O4令人滿意地保留了其大部分催化效率,這無疑是適配體對酪氨酸的選擇性捕獲。酪氨酸與適配體的特異性結(jié)合,增加了酪氨酸在Apt-Fe3O4上的停留時(shí)間,有利于活性中間體的形成,使反應(yīng)易于在擁擠的環(huán)境中進(jìn)行。這一特性有利于基于酪氨酸適配體的人工酶Apt-Fe3O4在復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中執(zhí)行催化任務(wù)。
圖3 人工酶的表征及其催化和熒光成像性能
3、FNA-Fe3O4的構(gòu)建與表征
其次,為實(shí)現(xiàn)人工酶對PD治療的高效BBB穿越和神經(jīng)元特異性響應(yīng),設(shè)計(jì)了由SNCA反義寡核苷酸和TfR適配體組成的阻斷鏈,并與Apt-Fe3O4上的酪氨酸適配體雜交,構(gòu)建了基于功能核酸的響應(yīng)型人工酶FNA-Fe3O4(圖3D)。
通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)驗(yàn)證FNA-Fe3O4響應(yīng)SNCA mRNA的鏈置換反應(yīng)性。如圖3e所示,嵌段鏈可以首先與酪氨酸適配體雜交(泳道4)。該雙鏈在酪氨酸的生理濃度范圍內(nèi)穩(wěn)定(泳道8)。然而,嵌段鏈隨后被SNCA mRNA取代以釋放游離的酪氨酸適體(泳道10)。同時(shí),監(jiān)測SNCA相關(guān)生物標(biāo)志物的含量可以為PD的熒光成像提供有效手段。
隨后測定了FNA-Fe3O4在SNCA mRNA存在和不存在時(shí)的酪氨酸羥化酶模擬活性。如圖3f中的動力學(xué)曲線所示,在水溶液和擁擠溶液中,F(xiàn)NA-Fe3O4與SNCA mRNA發(fā)生鏈置換反應(yīng)后表現(xiàn)出較高的催化活性。而單獨(dú)的FNA-Fe3O4的催化活性保持在較低的水平,尤其是在擁擠溶液中。這一特性提供FNA-Fe3O4不會影響正常細(xì)胞中多巴胺穩(wěn)態(tài)的潛力,僅在SNCA mRNA異常過表達(dá)的細(xì)胞中提供Dopa。
FNA-Fe3O4與SNCA mRNA反應(yīng)后,能夠連續(xù)捕獲酪氨酸溶液中的酪氨酸,并在含有H2O2和AA的溶液中催化酪氨酸羥基化,反應(yīng)5 min內(nèi)的多巴生成在4次重復(fù)中保持穩(wěn)定(圖3h),這將是人工酶典型的循環(huán)催化過程的有力證明。此外,以幾種常見的能夠芳香環(huán)羥基化的胞內(nèi)小分子(酪胺和苯丙氨酸)作為模型干擾物,測試人工酶對酪氨酸的底物選擇性。如圖3i所示,在反應(yīng)5 min內(nèi),F(xiàn)NA-Fe3O4 + mRNA對酪氨酸的羥基化轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)高于其他干擾物質(zhì),對酪氨酸表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性,證明了其胞內(nèi)抗干擾能力。此外,在含有酪氨酸、H2O2和AA的Apt-Fe3O4、FNA-Fe3O4和FNA-Fe3O4 + mRNA(10 μg mL-1)溶液中,反應(yīng)30 min后均未產(chǎn)生DNA片段,說明了反應(yīng)過程中DNA鏈的穩(wěn)定性。
4、FNA-Fe3O4的細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)
BBB是FNA-Fe3O4進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元的第一個(gè)障礙。因此,用表達(dá)TfR的永生化小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3)建立體外BBB模型,在頂端側(cè)加入人工酶,考察其穿膜效率(圖4a)。隨著時(shí)間的推移,F(xiàn)NA-Fe3O4在基底側(cè)逐漸累積,120 min后轉(zhuǎn)運(yùn)效率上升至21.8 %(圖4b)。相比之下,Apt-Fe3O4,Ran-Fe3O4,和不含TfR適配體的Fe3O4在基底側(cè)緩慢積累。這些結(jié)果表明FNA-Fe3O4可以高效地通過體外BBB模型,其中TfR適配體發(fā)揮了重要作用。
在驗(yàn)證了FNA-Fe3O4的跨BBB作用后,作者進(jìn)一步檢測其在神經(jīng)元中的內(nèi)化情況。作者使用TfR陽性的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2細(xì)胞作為PD的細(xì)胞模型。以Cy5修飾的不含BHQ2的FNA-Fe3O4為熒光探針,以Apt-Fe3O4和Ran-Fe3O4為熒光探針。與不含TfR適配體的Apt-Fe3O4和Ran-Fe3O4相比,F(xiàn)NA-Fe3O4對目標(biāo)BV2細(xì)胞具有更好的結(jié)合位移(圖4c)。代表FNA-Fe3O4的強(qiáng)烈Cy5熒光信號主要定位于BV2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,并在較長時(shí)間內(nèi)保持在胞內(nèi)高水平(圖4d)。細(xì)胞活性測試結(jié)果表明FNA-Fe3O4對BV2細(xì)胞幾乎沒有明顯的細(xì)胞毒性(圖4e),表明其與腦內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的生物相容性。這些性質(zhì)為FNA-Fe3O4的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
為評估核酸組分在FNA-Fe3O4上的功能,作者設(shè)計(jì)了兩種對照納米材料。Cat-Fe3O4代表酪氨酸羥化酶模擬活性的影響,ASO-Fe3O4代表反義寡核苷酸療法(圖5a-b)。作者通過其脫羧產(chǎn)物多巴胺的含量來監(jiān)測。如圖5c所示,F(xiàn)NA-Fe3O4處理的正常細(xì)胞內(nèi)多巴胺含量變化不大,表明其不會干擾正常神經(jīng)元內(nèi)多巴胺穩(wěn)態(tài)。在FNA-Fe3O4處理的PD細(xì)胞中,多巴胺含量在8 h內(nèi)呈逐漸上升趨勢,隨后達(dá)到穩(wěn)定平臺期。這一結(jié)果證明,F(xiàn)NA-Fe3O4可以在細(xì)胞中發(fā)揮類似酪氨酸羥化酶的功能,以應(yīng)對細(xì)胞特異性空間控制的SNCA mRNA的異常過度表達(dá)。同時(shí),Cat-Fe3O4也表現(xiàn)出類似的酪氨酸羥化酶模擬活性,而ASO-Fe3O4則沒有,這反映了酪氨酸適配體對人工酶催化的決定性作用。作者還嘗試了直接多巴孵育(0.5、2、8 μM)對細(xì)胞內(nèi)多巴胺水平的影響。孵育2 h后更換培養(yǎng)液模擬多巴胺短的血漿半衰期,細(xì)胞內(nèi)多巴胺含量逐漸降低(圖5d)。較高劑量的多巴維持了較長時(shí)間的多巴胺水平,但也導(dǎo)致了多巴胺含量更劇烈的波動。總的來說,多巴胺水平的長期增加意味著多巴治療的時(shí)間更長,而多巴胺水平的劇烈波動預(yù)示著神經(jīng)元中多巴胺的穩(wěn)態(tài)失調(diào)。這是導(dǎo)致多巴的治療效果和副作用控制無法平衡的根本原因。相比之下,F(xiàn)NA-Fe3O4提供的原位連續(xù)多巴產(chǎn)量表現(xiàn)出更長的持續(xù)時(shí)間和更可接受的多巴胺波動。需要指出的是,由于多巴和多巴胺的有效生理濃度遠(yuǎn)低于酪氨酸,因此應(yīng)用FNA-Fe3O4進(jìn)行酪氨酸羥基化不會影響細(xì)胞內(nèi)酪氨酸穩(wěn)態(tài)。
將阻斷鏈與SNCA mRNA雜交也降低了SNCA的表達(dá)。人工酶共孵育36 h后,F(xiàn)NAFe3O4和ASO-Fe3O4降低PD細(xì)胞模型SNCA蛋白表達(dá)水平(圖5e),有利于延緩神經(jīng)元退變。同在圖5f的熒光分析中,顯示EGFP綠色熒光信號的細(xì)胞為SNCA mRNA過表達(dá)細(xì)胞。FNA-Fe3O4對共培養(yǎng)的正常細(xì)胞和PD細(xì)胞顯示出不同的熒光信號強(qiáng)度,證明FNA-Fe3O4可以響應(yīng)過表達(dá)的SNCA mRNA通過熒光成像區(qū)分正常和PD神經(jīng)元(圖5g)。相應(yīng)的流式細(xì)胞儀獲得了一致的熒光分析結(jié)果(圖5h)。這些結(jié)果表明FNA-Fe3O4能夠監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)SNCA mRNA的表達(dá)水平。
圖4 人工酶的細(xì)胞可利用性
圖5 人工酶的細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)
5、FNA-Fe3O4的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)
研究分別以野生型小鼠和攜帶小鼠胸腺細(xì)胞抗原1(Thy1)啟動子驅(qū)動的人野生型SNCA的Thy1-SNCA轉(zhuǎn)基因小鼠作為正常和PD動物模型。與正常小鼠相比,尾靜脈注射FNA-Fe3O4后4 h內(nèi),PD小鼠腦內(nèi)可觀察到逐漸增強(qiáng)的Cy5熒光信號(圖6a),表明FNA-Fe3O4可實(shí)現(xiàn)PD動物模型的成像。
隨后,在PD小鼠尾靜脈注射Cat-Fe3O4、ASO-Fe3O4或FNA-Fe3O4(4 mg kg-1)時(shí)進(jìn)行紋狀體微透析,分析人工酶催化原位Dopa產(chǎn)生。具有類酪氨酸羥化酶特性的Cat-Fe3O4和FNA-Fe3O4使腦組織中多巴和多巴胺水平升高至略低于正常水平,而ASO-Fe3O4未引起多巴和多巴胺水平的變化(圖6b-c)。這一趨勢表明人工酶介導(dǎo)了腦內(nèi)多巴胺系列神經(jīng)遞質(zhì)生成的恢復(fù)。相應(yīng)地,比較了Dopa給藥期間的微透析結(jié)果。多巴胺的上升趨勢只維持了(約4 h內(nèi))短暫的時(shí)間且波動較大(圖6d),從而顯示出人工酶策略的優(yōu)越性。經(jīng)過20天的治療后(圖6e),反義寡核苷酸ASO-Fe3O4和FNA-Fe3O4顯著降低了腦組織中SNCA的表達(dá),而Cat-Fe3O4對過表達(dá)SNCA的影響可以忽略(圖6f)。這一結(jié)果揭示人工酶上反義寡核苷酸部分對于調(diào)控過表達(dá)SNCA的重要性。
持續(xù)的原位多巴生成和緩解異常的SNCA過表達(dá)共同作用于Thy1-SNCA小鼠的PD病理特征。因此,進(jìn)一步通過爬桿實(shí)驗(yàn)和懸線實(shí)驗(yàn)(圖6g-h)評價(jià)小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力。可見,PD小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力明顯差于健康小鼠。Cat-Fe3O4和ASO-Fe3O4部分恢復(fù)了PD小鼠的運(yùn)動能力,分別反映了酪氨酸羥化酶替代治療和反義寡核苷酸治療對PD癥狀的緩解。單獨(dú)使用Cat-Fe3O4的治療效果略優(yōu)于ASO-Fe3O4,因?yàn)樵欢喟凸┙o可以直接作用于多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)。反義寡核苷酸治療的貢獻(xiàn)在于緩解PD病理過程,因此FNA-Fe3O4治療的小鼠表現(xiàn)出比單藥治療更好的性能。此外,PD小鼠可表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力的下降,可通過被動回避實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。24 h滯留中更長的穿越潛伏期代表更完整的學(xué)習(xí)記憶。在PD小鼠中給予Cat-Fe3O4和ASO-Fe3O4在相似的水平上有助于改善學(xué)習(xí)和記憶的下降,并且FNA-Fe3O4治療更明顯。這些結(jié)果表明FNA-Fe3O4可以促進(jìn)PD小鼠模型的運(yùn)動障礙和記憶缺陷的恢復(fù),其治療作用來源于酪氨酸羥化酶模擬活性和反義寡核苷酸的協(xié)同作用。
圖6 人工酶的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)
實(shí)驗(yàn)方法
SH-SY5Y和bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng),體外構(gòu)建血腦屏障細(xì)胞模型,人工酶的細(xì)胞內(nèi)化,CCK-8,細(xì)胞內(nèi)多巴胺和酪氨酸含量的測定,qRT-PCR,免疫印跡,人工酶對細(xì)胞SNCA mRNA的熒光分析,C57BL/6 N(6個(gè)月)小鼠,Thy1-SNCA 轉(zhuǎn)基因小鼠,F(xiàn)NA-Fe3O4中塊鏈的質(zhì)譜,離體成像,體內(nèi)血液循環(huán)測定,免疫熒光,血清生化分析,溶血試驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
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