胰腺導管腺癌（PDA）的特點是較強的局部侵襲和轉移性擴散，導致高致死率。雖然PDA進展過程中的驅動基因突變是保守的，但沒有特定的突變與轉移相關。在此，作者分析了大量原發性和轉移性PDA腫瘤的RNA剪接數據，以確定與PDA進展相關的不同剪接事件。發現，RBFOX2的剪接調控功能是PDA的腫瘤抑制因子，并提出了一種治療轉移性PDA的方法。本文于2023年5月發表在《Nature》IF：69.5期刊。

技術路線：

主要實驗結果：
1、PDA的AS事件整體情況
       文獻分析PDA基因組揭示的4個PDA驅動關鍵基因KRAS，SMAD4，CDKN2A，TP53，但它們都在PDA進展中保守，沒有關于它們突變對PDA轉移進展的報道。此外，AS事件在PDA中發揮重要作用，所以作者猜想AS事件可能在PDA轉移中扮演某種未知作用。為此，作者對395個PDA患者樣本的RNA測序數據進行AS事件的PCA分析，發現了兩個cluster?；谂R床和/或病理信息的集群注釋顯示，這兩個集群與腫瘤部位相關性良好，61%的原發性胰腺腫瘤屬于cluster 1，71%的轉移性腫瘤屬于cluster 2（圖1a）。關注原發組和轉移組之間最穩健的差異剪接事件，使用被正確注釋為原發或轉移腫瘤的樣本進行進一步分析（圖1a，方框小圖）。在原發組和轉移組之間鑒定了大約8000個顯著差異的剪接事件。前20個剪接事件足以將PDA患者樣本分為與臨床分期高度相關的兩組（圖1b）。
       對顯著差異剪接事件的Reactome通路富集分析顯示，參與細胞骨架組織和遷移的RHO GTPase通路基因富集（圖1c）。然后，對RHO通路基因的差異剪接事件進行了無偏倚的從頭基序分析。這些事件的5 '剪接位點上游最豐富的基序與RBFOX2結合序列具有高度同源性（圖1d）。我們觀察到在PDX衍生的轉移性患者樣本中，剪接因子RBFOX2的蛋白水平低于原發腫瘤樣本，而mRNA水平沒有明顯差異（圖1e-g）。這些結果表明一個可能的機制，即RBFOX2介導的剪接可能通過細胞骨架的變化調節轉移過程。

圖1 PDA的AS事件整體情況

2、RBFOX2是轉移抑制因子
       接下來研究RBFOX2是否直接影響PDA細胞的轉移能力。為此，用表達RBFOX2的逆轉錄病毒轉導PDX衍生的轉移細胞X50和X139（圖2a）。RBFOX2的過表達極大地降低了這些細胞的轉移潛力，這可以從它們在傷口愈合試驗中的遷移減少和與對照組細胞相比的菌落形成抑制中觀察到，而不影響增殖（圖2b-c）。為測試RBFOX2對體內侵襲的影響，將用RBFOX2 cDNA的mCherry標記的X50 PDX細胞靜脈注射到NOD-SCID小鼠體內。與注射對照細胞的小鼠相比，觀察到肺轉移瘤的數量大幅減少（圖2d）。這些結果表明，RBFOX2的過表達抑制PDA細胞的轉移潛力。使用兩種不同的CRISPR引導RNA對RBFOX2進行敲除，明顯增加了BxPC3原代PDA細胞和原代PDX衍生的細胞系（X252）的集落形成和遷移率，同樣，沒有檢測到對增殖的影響（圖2a, e, f）。將GFP標記的RBFOX2耗盡的BxPC3原代PDA細胞靜脈注射到NOD-SCID小鼠體內，發現與對照細胞相比，肺轉移的數量增加，腫瘤體積明顯增大（圖2g）。為確認這些表型是否歸因于RBFOX2的耗竭，設計一種針對RBFOX2中外顯子-內含子交界處的sgRNA（RBFOX2 EIJ sgRNA），從而只沉默內源性的RBFOX2（圖2a）。用RBFOX2 EIJ sgRNA處理的Cas9表達的BxPC3細胞具有與RBFOX2基因敲除細胞類似的表型，將RBFOX2的cDNA引入這些細胞可挽救其表型（圖2h, i）。
       RBFOX2蛋白含有一個RNA識別圖案（RRM），它可以識別共識序列GCAUG。為確定RBFOX2的剪接調節活性是否是其對轉移性PDA的影響的原因，用敲除RRM的RBFOX2 cDNA（RBFOX2^ΔRRM）來拯救表達RBFOX2 EIJ sgRNA的X50轉移性PDA細胞和BxPC3原生PDA細胞的表型。表達RBFOX2^ΔRRM并沒有減弱這兩種細胞系的表型，這表明RBFOX2的RRM對其在PDA進展中的腫瘤抑制活性是必不可少的。

圖2 RBFOX2在胰腺癌進展中作為轉移性腫瘤抑制因子

3、RBFOX2介導局灶黏附       
       為確定調節PDA細胞轉移過程的基本RBFOX2剪接目標，作者確定了114個RBFOX2依賴的交替剪接事件，這些事件在每個比較組中都是相互調節的，P值小于0.05，|ΔPSI|大于10%（圖3a, b）。Reactome分析顯示，87個RBFOX2調控的基因在RHO GTPase (RHOA、CDC42和RAC1)通路上的富集（圖3c）。

4、RBFOX2抑制RHO GTPase通路
       為研究RBFOX2對RHO GTP酶途徑的調節是否對胰腺癌的進展至關重要，利用兩種RHO GTP酶途徑的抑制劑： MBQ167和硫唑嘌呤。對RBFOX2缺失的BxPC3細胞施用MBQ167可抑制其遷移率，但體外的存活率或增殖率沒有變化（圖3d-f）。對靜脈注射GFP標記的RBFOX2耗盡的BxPC3細胞或GFP標記的PDX衍生的轉移性X50細胞的小鼠體內給予MBQ167，可抑制肺部轉移（圖3g-h）。

圖3 RBFOX2調控胰腺癌進展中的AS事件

5、RBFOX2調控的PDA進展與MPRIP 23號外顯子跳躍異構體有關
       在本研究中發現的RBFOX2調節的剪接事件之一是MPRIP的剪接。MPRIP最初被確定為一種RHOA結合蛋白，并被發現與F-actin和MYPT1結合。此外，據報道，MPRIP通過其RHO GTP酶激活蛋白的活性抑制RHOA，表明對RHOA-ROCK途徑有抑制性調節活性。然而，還沒有關于MPRIP的剪接異構體及其在轉移中的作用的報道。過表達RBFOX2誘導MPRIP的23號外顯子包含，而RBFOX2敲除則誘導跳躍該外顯子（圖4a,b）。與原發腫瘤相比，轉移性PDA樣本中MPRIP 23號外顯子跳躍異構體的數量較高（PSI較低）（圖4c）。根據PSI中值，MPRIP低組的患者生存結果更差（圖4d）。這些結果支持這種MPRIP剪接事件在PDA進展中的臨床意義。因此，作者預測MPRIP 23號外顯子跳躍異構體與PDA進展中的致癌活性有關。
       接下來測試MPRIP剪接的調控是否會影響PDA腫瘤細胞系的轉移潛力。為誘導MPRIP 23號外顯子跳躍異構體，設計了針對第23外顯子的3′或5′剪接位點的CRISPR sgRNAs。這兩種sgRNA都能觸發23號外顯子的有效跳轉（圖4e）。與對照組細胞相比，表達這些sgRNAs的BxPC3原代腫瘤細胞在軟瓊脂中表現出更強的遷移能力和菌落形成，但對增殖率沒有影響（圖4f,g）。將GFP標記的BxPC3原發腫瘤細胞用3′或5′剪接位點sgRNAs靜脈注射到NOD-SCID小鼠體內，與對照細胞相比，肺轉移灶的數量明顯增加（圖4h）。
       為強制MPRIP的第23外顯子包含在轉移細胞中，設計一個sgRNA，破壞了位于第24外顯子3′非翻譯區的RBFOX2圖案（GCAUG）。通過基于CRISPR的誘變中斷RBFOX2圖案，增加了外顯子23的包含（圖4i）。攜帶靶向RBFOX2圖案的sgRNA（DS-24 MPRIP sgRNA）的X50轉移細胞顯示出明顯減慢的遷移能力，軟瓊脂中的菌落形成減少，但對增殖率沒有影響（圖4j,k）.9b）。為研究MPRIP剪接調制在體內的影響，將表達CRISPR對照或DS-24 MPRIP sgRNA的GFP標記的X50轉移細胞靜脈注射到NOD-SCID小鼠體內。值得注意的是，在注射表達MPRIP外顯子23保留異構體的轉移的X50細胞，抑制了體內的轉移潛力（圖4l）。
       以上結果表明RBFOX2調控的PDA進展與MPRIP 23號外顯子跳躍異構體有關。

圖5 調節MPRIP剪接調控胰腺腫瘤細胞的轉移潛能

       總之，本研究表明剪接因子RBFOX2在PDA中作為轉移性抑制因子的作用，并確定了轉移性PDA中RBFOX2調節的替代剪接特征。RBFOX2調節的剪接目標中檢測到RHO GTP酶通路基因的富集，并證明它們在胰腺癌細胞入侵中的功能作用。對RHO-RAC途徑的藥理操作或對這些途徑中的替代剪接事件的精確調控可以改變致癌性與腫瘤抑制性異構體的平衡，并可能具有作為PDA治療目標的潛力。

實驗方法：
RNA-seq，PCA分析，可變剪接（AS）分析，序列motif分析，裸鼠PDA PDX模型構建，細胞培養，免疫印跡，mRNA穩定性實驗，蛋白穩定性實驗，CRISPR–Cas9技術敲低或剪接調控，慢病毒和逆轉錄病毒感染，貼壁不依賴性生長實驗，劃痕實驗，臺盼藍排除生存試驗，RT–PCR，RT–qPCR，免疫熒光，小鼠轉移模型構建，小鼠荷瘤模型，HE，IHC，IP，質譜
參考文獻：
Jbara A, Lin KT, Stossel C, Siegfried Z, Shqerat H, Amar-Schwartz A, Elyada E, Mogilevsky M, Raitses-Gurevich M, Johnson JL, Yaron TM, Ovadia O, Jang GH, Danan-Gotthold M, Cantley LC, Levanon EY, Gallinger S, Krainer AR, Golan T, Karni R. RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer. Nature. 2023 May;617(7959):147-153. doi: 10.1038/s41586-023-05820-3. Epub 2023 Mar 22. PMID: 36949200; PMCID: PMC10156590.