缺血再灌注損傷(IRI)是急性腎損傷(AKI)的常見原因。AKI中m6A修飾的作用尚不清楚。在這里，我們描述了ALKBH5和m6A修飾在I/R誘導的雄性小鼠腎損傷模型中的作用。與野生型小鼠相比，Alkbh5敲除小鼠IRI后的病理損傷較輕，腎功能較好，而Alkbh5敲入小鼠則相反。此外，在管上皮細胞中條件敲除Alkbh5可減輕I/R誘導的AKI和纖維化。CCL28被確定為ALKBH5的靶標。此外，隨著Alkbh5缺乏，Ccl28 mRNA的穩定性增加。在IRI-Alkbh5^fl/fl Ksp^Cre小鼠中，升高的CCL28水平上調了Treg募集，抑制了炎癥細胞。ALKBH5抑制劑IOX1對I/R誘導的AKI具有保護作用。綜上所述，抑制ALKBH5可促進Ccl28 mRNA的m6A修飾，增強其穩定性，調節Treg/炎癥細胞軸。ALKBH5和這個軸是一個潛在的AKI治療靶點。本文于2023年3月發表于Nature Communications（IF=16.6）上。
技術路線

結果
1）m6A修飾和ALKBH5參與腎臟IRI和mRTECs的缺氧和復氧(H/R)反應
       為了研究m6A修飾是否參與腎IRI，我們檢測了從IRI小鼠腎組織中提取的RNA的m6A水平。m6A水平在IRI后12小時開始下降，但在24小時和48小時急劇上升，然后在IRI后120小時恢復到接近正常水平(圖1a)。為了確定哪些m6A修飾的調控因子在IRI中起作用，我們使用GEO數據庫的數據進行了單細胞測序分析，發現去甲基化酶Alkbh5是最顯著的改變基因(補充圖，未展示)。然后，我們測量了腎組織中幾種已知的m6A甲基轉移酶和去甲基化酶相關蛋白的RNA表達水平。Alkbh5的表達在12 h時升高，在24 h和48 h時下降，IRI后120 h開始恢復(圖1b)。其他調節因子的變化如圖1b所示，其中Alkbh5的變化最為明顯。這些蛋白的Western blotting (WB)分析顯示了相同的變化，與實時定量PCR (RT-qPCR)結果一致(圖1c)。蓮藕凝集素(LTL)和ALKBH5的免疫熒光(IF)染色顯示，ALKBH5主要在RTECs中表達，并在IRI后24 h表達減少(圖1d)。H/R應用于mRTECs。隨后，測定m6A修飾、m6A甲基轉移酶和去甲基化酶mRNA表達水平。結果顯示，與對照組相比，H/R組(6 H和12 H復氧)的m6A修飾增加(圖1e)。H/R組Alkbh5、Fto、和Wtap mRNA表達下調，Mettl3和Mettl14 mRNA表達上調(圖1f)。WB分析也驗證了類似的結果(圖1g)。這些數據表明，常見的m6A甲基轉移酶和去甲基化酶，尤其是ALKBH5的表達水平在腎臟IRI過程中發生了顯著變化，表明m6A修飾可能在這一過程中發揮了重要作用。

2）Alkbh5缺乏和過表達改變了I/R誘導的AKI和纖維化
       為了研究ALKBH5在腎IRI中的作用，我們構建了ALKBH5敲除(KO)和ALKBH5敲入(KI)小鼠。隨后，我們對WT、KO和KI小鼠進行了45分鐘的單側腎蒂夾持或假手術(圖2a)。在IRI-KO和IRI-KI組中，m6A甲基化分別高于和低于IRI-WT組(圖2b, c)。在Sham-WT、Sham-KO和Sham-KI組中，無論是在腎功能分析(包括血清肌酐和血尿素氮(BUN))(圖2d-g)還是在病理評分分析(圖2h-k)中，都沒有顯著差異。然而，在IRI組中，KO小鼠表現出更好的腎功能(血清肌酐和BUN降低；圖2d, f)，輕度腎損害(圖2h-j)，腎細胞凋亡較少(圖2l)。相應地，IRI-KI小鼠表現出更差的腎功能(圖2e, g)，更嚴重的腎損害(圖2k)。IRI后4周采用Sirius red和Masson染色檢測腎纖維化的嚴重程度，結果顯示IRI-KO小鼠比IRI-WT小鼠表現出更少的陽性染色點(圖2,n)。我們的數據顯示，Alkbh5缺乏可防止I/R誘導的AKI和纖維化。相反，Alkbh5過表達加重了I/R后的腎損傷。

3）RTECs中Alkbh5缺乏保護I/R誘導的AKI和纖維化
       為了研究RTECs中Alkbh5的缺失是否對腎IRI具有保護作用，我們將Alkbh5^fl/fl小鼠與Ksp^Cre小鼠雜交，構建了Alkbh5-cKO小鼠。免疫熒光染色(圖3b)驗證了RTECs中Alkbh5的缺失。隨后，我們在Alkbh5^fl/fl和Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠中誘導IRI(圖3a)。m6A點印跡顯示，與IRI-Alkbh5^fl/fl組相比，IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre組m6A甲基化進一步增加(圖3c)。假手術小鼠的血清肌酐和BUN水平在Alkbh5^fl/fl和Alkbh5^fl/flKsp^Cre之間無顯著差異(圖3d, e)，但IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre組在IRI后24 h和48 h的血清肌酐和BUN水平均顯著低于IRI-Alkbh5^fl/fl組(圖3d, e)。接下來，我們在IRI后24小時收集四組腎臟組織進行病理分析。H&E和PAS染色顯示，RTECs中Alkbh5缺乏減輕了I/R后腎損傷(圖3f-h)。此外，TUNEL染色也顯示Alkbh5 cKO可以減少細胞凋亡(圖3i)。這些數據表明，RTECs中Alkbh5的缺失對I/R誘導的AKI具有保護作用。為了進一步確定Alkbh5缺乏在I/R 4周后慢性腎損傷中的作用，我們進行了天狼星紅和Masson染色。IRI-Alkbh5^{fl/ fl}Ksp^Cre組比IRI-Alkbh5fl/fl組表現出較輕的纖維化(圖3j, k)。總的來說，RTECs中Alkbh5缺乏有效地保護了I/R后的AKI和慢性纖維化。

4）Alkbh5-KO小鼠m6A修飾及基因表達變化的表征
       為了確定腎臟IRI開始時ALKBH5的直接m6A去甲基化靶點，我們在I/R后24小時使用WT和KO小鼠IRI小鼠腎臟分離的RNA進行了甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)和RNA測序(RNA-seq)。根據MeRIP-seq分析，m6A修飾通常位于一致的“RGAAR”基序(R = a或G)(圖4a)。m6A峰在終止密碼子附近尤其豐富(圖4b, c)。MeRIP-seq分析發現KO組有1754個高甲基化峰。RNA-seq結果顯示，與WT組相比，KO組有1779個基因表達上調，1331個基因表達下調(圖4d)。使用RNA-seq和MeRIP-seq數據進行KEGG分析，揭示了與免疫和代謝相關的多種信號通路，如細胞因子-細胞因子受體相互作用、TNF信號、IL-17信號等(圖4e、f)。為了進一步評估相應基因的mRNA表達和m6A甲基化水平，我們選擇了差異表達最多的基因(圖4g、4h)。此外，我們使用四象限散點圖對四個不同的亞群及其功能進行了深入的數據分析(圖4i)。為了找到ALKBH5最可能的直接靶基因，我們選擇了與高甲基化相關的上調或下調最多的基因，如Ccl28、Sh2d5、Ngfr和Tfr2(圖4i)。在MeRIP-seq數據中，我們發現KO組在Ccl28 mRNA的停止密碼子周圍有一個m6A峰，而在WT組中減少(圖4j)。Ccl28是表達倍數變化最大的顯著差異表達基因，因此我們假設Ccl28是ALKBH5的直接靶基因。

5）CCL28是ALKBH5的直接靶點
       采用RT-qPCR、WB和免疫組化(IHC)檢測IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre組和IRI-Alkbh5^fl/fl組Ccl28的表達水平。結果顯示，在Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠中，CCL28的mRNA和蛋白比IRI-Alkbh5^fl/fl小鼠更豐富(圖5a-c)。ELISA法也觀察到血清中CCL28的類似變化(圖5d)。然后用抗m6A抗體或IgG抗體進行MeRIP檢測。與IgG抗體相比，抗m6A抗體的免疫沉淀導致Ccl28 mRNA水平高度富集(圖5e)。這些結果表明m6A修飾參與了ALKBH5對Ccl28 mRNA的調控。為了確定ALKBH5和Ccl28 mRNA是否存在直接相互作用，我們使用腺病毒標記的ALKBH5載體(Ad-ALKBH5)進行了RNA-IP。與IgG抗體相比，抗Flag抗體組的免疫沉淀顯示Ccl28 mRNA水平更高(圖5f)。ALKBH5過表達會降低pGL3-CDS的熒光素酶活性，但不會降低pGL3-5'UTR或pGL3-3'UTR的熒光素酶活性(圖5g)。ALKBH5過表達降低pGL3-CCL28-WT和pGL3-CCL28-Mut1,2,3,的熒光素酶活性，但不影響pGL3-CCL28-Mut4(圖5h)。這表明Ccl28 mRNA上潛在的m6A位點(Mut4)是Alkbh5介導的去甲基化位點。
       先前的研究報道了ALKBH5通過m6A去甲基化破壞了mRNA的穩定性，因此我們假設ALKBH5缺乏穩定了Ccl28 mRNA。在通過actinomycin D抑制RNA聚合酶后的0、2、4和6小時檢測mRTECs中Ccl28 mRNA的水平。RT-qPCR結果顯示，敲低ALKBH5后，Ccl28的半衰期延長，表明ALKBH5的降低穩定了Ccl28 mRNA(圖5i)。IGF2BPs是m6A讀取器，具有增強mRNA穩定性的作用。因此，我們檢測IGF2BPs (IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3)是否參與Ccl28 mRNA穩定性的調控。當IGF2BP2被敲除時，Ccl28 mRNA的表達明顯抑制。但IGF2BP1或IGF2BP3的敲低作用有限(圖5j)。WB分析還表明，IGF2BP2敲低抑制CCL28蛋白豐度(圖5k)。使用抗IGF2BP2抗體的RNA免疫沉淀(RIP)分析進一步證實了H/R mRTECs中IGF2BP2和Ccl28 mRNA之間的相互作用(圖51)。RNA穩定性分析顯示，IGF2BP2敲低逆轉了ALKBH5敲低對Ccl28 mRNA的穩定性增強作用(圖5m)。因此，我們確定IGF2BP2是調控Ccl28mRNA穩定性的閱讀蛋白。

6）Alkbh5缺乏增加了CCL28介導的Treg募集
       為了確定CCL28在AKI中的功能，我們檢測了IRI后不同時間點腎組織中CCL28的表達水平。結果顯示，Ccl28在IRI后表達增加，并在120 h達到峰值(圖6a)。接著，我們檢測了IRI后不同時間點腎臟組織中Tregs的浸潤情況。Treg的數量變化與Ccl28的表達一致(圖6b-d)。隨著Alkbh5的降低，Ccl28和Tregs的水平升高(圖6e)。我們假設Treg的募集參與了Alkbh5缺乏和CCL28上調在IRI中誘導保護作用的機制。我們比較了不同組在IRI后24 h腎組織中Tregs的百分比。IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre組Tregs的浸潤量明顯高于IRI-Alkbh5^fl/fl組(圖6f、g)。為了進一步探索CCL28是否確實是募集Treg的關鍵因素，我們給不同組的小鼠注射了抗CCL28抗體(圖6h)。在抗CCL28抗體治療后，IRI后Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠的Tregs百分比與未治療的Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠相比顯著降低(圖6i, j)。然后，我們使用體外transwell實驗測試了對新分離的小鼠外周血單個核細胞(PBMCs)的趨化活性。在H/R + Ad-sh-ALKBH5組中，CCL28水平顯著升高，而在H/R + Ad-sh-ALKBH5+抗CCL28組中，CCL28水平被抗CCL28抗體逆轉(圖6k)。我們觀察到，H/R+Ad-sh-ALKBH5組CD4+細胞中Foxp3+CD4+細胞的百分比增加，CCL28抗體給藥后Foxp3+CD4+細胞的百分比顯著下降(圖61,m)。

7）在I/R誘導的AKI中，CCL28/Treg/炎癥細胞軸參與了Alkbh5缺乏治療效果的機制
       先前的一項研究報道，Tregs抑制腎IRI中的中性粒細胞、巨噬細胞和先天免疫系統。我們結果表明，與Alkbh5^fl/fl小鼠相比，Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠IRI腎組織中Ly6G⁺中性粒細胞和F4/80⁺巨噬細胞較少(圖7a)。為了證明CCL28/Treg/炎癥細胞軸的功能，我們將CCL28和CD25抗體分別給予Alkbh5^fl/flKsp^Cre或Alkbh5^fl/fl小鼠。針對Ly6G和F4/80的免疫組化染色顯示，與未給藥CCL28或CD25抗體的小鼠相比，給藥CCL28或CD25抗體顯著增加了Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠的中性粒細胞和巨噬細胞數量(圖7a)。腎功能和病理分析顯示，CCL28或CD25抗體治療逆轉了Alkbh5缺乏的保護作用(圖7b-e)。綜上所述，CCL28和Treg阻斷有效抑制了Alkbh5基因敲除的保護作用。CCL28/Treg/炎癥細胞軸是ALKBH5在IRI中的直接下游靶點。

8）ALKBH5抑制劑IOX1和重組小鼠CCL28在IRI中發揮保護作用
       先前的研究發現IOX1是ALKBH5的抑制劑。我們在IRI模型中測試了IOX1和CCL28的作用(圖8a)。IOX1有效地增加了m6A甲基化，但在Ccl28治療的IRI組中沒有觀察到顯著差異(圖8b)。IOX1或CCL28處理可降低I/R后血清肌酐和BUN濃度(圖8c、d)。H&E染色數據表明，IOX1或CCL28處理可減輕I/R誘導的腎損傷(圖8e、f)。接下來，我們檢測腎組織中Treg、中性粒細胞和巨噬細胞的百分比。在IOX1和CCL28治療組中發現Treg募集增加(圖8g, h)。相應地，與未治療的IRI小鼠相比，IOX1或CCL28治療組中性粒細胞和巨噬細胞數量減少(圖8i)。

結論
       我們的研究表明，Alkbh5缺乏通過增加CCL28 mRNA m6A甲基化來上調CCL28的水平，從而增加CCL28 mRNA的穩定性。通過增加CCL28水平募集Treg，保護腎臟免受炎癥細胞浸潤的抑制。我們的工作將豐富目前對AKI中m6A甲基化和ALKBH5分子機制知之甚少的知識。我們還發現了ALKBH5/CCL28/Treg軸在I/R誘導的AKI中的調控作用。總的來說，我們的發現有望為治療I/R誘導的AKI提供一種潛在的策略。

實驗方法
腺病毒(Ad)轉導，小鼠腎IRI模型構建，Masson’s trichrome染色，Sirius Red染色，RT-qPCR，Western blot，PAS染色，HE染色，免疫組化，免疫熒光，流式，ELISA，m6A點印記，Transwell，雙熒光素酶報告實驗，MeRIP，RIP，MeRIP-seq，RNA-seq。
參考文獻
Chen J, Xu C, Yang K, Gao R, Cao Y, Liang L, Chen S, Xu S, Rong R, Wang J, Zhu T. Inhibition of ALKBH5 attenuates I/R-induced renal injury in male mice by promoting Ccl28 m6A modification and increasing Treg recruitment. Nat Commun. 2023 Mar 1;14(1):1161. doi: 10.1038/s41467-023-36747-y.