? 糖尿病是一種以胰島素抵抗、高血糖和炎癥紊亂為特征的疾病，會導致嚴重的牙周炎。與慢性牙周炎（CP）相比，糖尿病性牙周炎（DP）對牙周組織的破壞更為嚴重。DP的高糖環境會導致宿主免疫炎癥反應失調，從而引發持續炎癥，加速牙周破壞。糖尿病患者的慢性不愈合或愈合緩慢的傷口通常與長期炎癥和中性粒細胞持續性有關。此外，隨著胞葬的生物學行為，巨噬細胞分泌大量抗炎分子，表明這一過程是促進炎癥消退和組織修復所必需的。新出現的證據強調了胞葬受損在多種炎癥性疾病中的作用，而胞葬在DP中的生理功能尚未完全確定。SIRT6作為一種NAD依賴性組蛋白去乙酰化酶，在糖代謝、炎癥穩態和長壽中具有轉錄調節功能。髓細胞特異性SIRT6缺乏通過調節巨噬細胞表型，延遲高脂飲食小鼠的傷口愈合并引起胰島素抵抗。此外，對糖尿病患者的研究表明，SIRT6在許多人體組織中表達不足，這表明SIRT6對糖尿病相關疾病具有保護作用。因此，探索SIRT6調控免疫穩態的潛在機制，可能對DP患者實現良好的牙周組織保存具有重要的臨床意義。該研究發表于《Theranostics》，IF：11.6。
技術路線：

主要研究結果：
1. 人DP中中性粒細胞和巨噬細胞的特征分布
       為了探索糖尿病相關炎癥性疾病中細胞群組成和調節細胞通路的差異，作者在單細胞測序數據集GSE165816中分析了來自健康非糖尿病和糖尿病足潰瘍非愈合者的足部皮膚樣本。GO富集分析結果顯示，炎癥和細胞凋亡相關通路被激活（圖1A, B）。在鑒定的炎癥細胞中，作者重點關注巨噬細胞浸潤增加，并通過GO分析和統一流形逼近與投影（UMAP）分析進一步鑒定巨噬細胞簇的細胞群。值得注意的是，UMAP分析顯示巨噬細胞異常極化（圖1C）。GO富集分析顯示，與非糖尿病對照的巨噬細胞相比，糖尿病巨噬細胞中與免疫應答、吞噬、遷移能力和葡萄糖代謝相關的通路出現異常（圖1D, E）。這些結果表明，糖尿病創面愈合過程中異常炎癥反應可能是由于細胞凋亡相關通路大量激活，巨噬細胞吞噬能力異常所致。
       為了進一步探討DP持續升高的炎癥是否與巨噬細胞吞噬能力異常有關，作者收集了伴有或不伴有糖尿病的牙周炎患者的牙齦樣本（圖1F）。在牙周炎中，巨噬細胞引起的中性粒細胞胞葬被認為是抗炎和促進消退的事件。糖尿病的慢性炎癥通常很嚴重且很難治愈。因此，作者首先檢測了牙齦中的中性粒細胞，結果顯示DP組的中性粒細胞浸潤（CD15）細胞數量高于CP組（圖1G, L）。使用牙齦組織連續切片進行TUNEL染色，結果顯示DP組的牙齦組織中有大量凋亡細胞，而CP組幾乎未見凋亡細胞（圖1H, M）。通過對相同位點的連續切片的比較觀察，作者發現大多數凋亡細胞為CD15中性粒細胞（圖1G, H）。隨后，作者利用MPO和H3CIT標記物中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）發現，DP中中性粒細胞的過度積累和延遲清除導致大量NETs的形成（圖1I, N），從而加重了糖尿病患者的炎癥并延遲了炎癥的消退。為了進一步探討未及時清除的凋亡中性粒細胞是否由巨噬細胞浸潤異常引起，作者對巨噬細胞極化進行免疫熒光染色。DP組牙齦中巨噬細胞（CD68）的浸潤量遠高于CP組（圖1O）。DP組CD68 CD86陽性M1巨噬細胞浸潤量高于CP組（圖1J, P），CD68 CD206陽性M2極化巨噬細胞浸潤量DP組與CP組無差異（圖1K, Q），但DP組M2/M1比值明顯低于CP組（圖1R）。綜上所述，凋亡中性粒細胞和NETs的過度積累和延遲清除，伴隨著巨噬細胞浸潤增加和巨噬細胞極化破壞，無疑加重了DP炎癥。

圖1 人DP中中性粒細胞和巨噬細胞的特征分布

2. 功能失調的中性粒細胞和巨噬細胞加重了小鼠DP的炎癥損傷并損害炎癥消退
       為了探討糖尿病對牙周炎進展和炎癥消退的影響，作者使用了兩種經典的結扎性牙周炎（LIP）小鼠模型，即牙周炎模型和牙周炎消退模型。牙周炎模型結扎過程長達14天，牙周炎消退模型小鼠結扎7天，然后拆除結扎物，再模擬7天的炎癥消退過程（圖2A）。在牙周炎和牙周炎消退模型中，糖尿病小鼠從CEJ到ABC的距離都明顯增加（圖2B, I）。在牙周炎和牙周炎消退模型中，與CP組相比，糖尿病小鼠表現出更高的破骨細胞活性，TRAP陽性破骨細胞表面出現更高（圖2C, J）。此外，在DP牙周組織中可見大量中性粒細胞浸潤、MPO和H3cit NETs（圖2D, K, E, L）。TUNEL染色也顯示DP牙周組織中有大量凋亡細胞，而CP組未見明顯凋亡細胞（圖2F, M）。DP中F4/80巨噬細胞浸潤數量大于CP組（圖2N）。具體而言，DP組F4/80 CD86 M1巨噬細胞（圖2G, O）和F4/80 CD206 M2巨噬細胞（圖2H, P）數量明顯高于CP組。然而，在LIP模型的分辨率上，DP組的M2/M1巨噬細胞比例也明顯低于CP組（圖2Q）。總的來說，凋亡中性粒細胞和NETosis在牙周組織中的積累加速了牙周炎的進展，而凋亡中性粒細胞和NETs的延遲清除阻礙了小鼠DP炎癥的消退。

圖2 功能失調的中性粒細胞和巨噬細胞加重了小鼠DP的炎癥損傷并損害炎癥消退

3. SIRT6顯著調節高糖條件下巨噬細胞的胞葬作用
       鑒于上述結果，作者進一步解讀HG是否抑制巨噬細胞對凋亡中性粒細胞的胞葬作用，從而間接增加其殘基。HG刺激后巨噬細胞吞噬凋亡中性粒細胞的能力下降（圖3A）。鑒于DM中巨噬細胞簇的GO富集分析顯示NAD代謝異常（圖1D, E），作者進一步檢查發現HG刺激可導致NAD/NADH代謝異常（圖3B）。Sirtuins（SIRTs）是NAD依賴性組蛋白去乙酰化酶家族，在葡萄糖穩態、炎癥、基因組穩定性和DNA修復中發揮作用。因此，由于SIRT6在HG條件下明顯下調，在48 h和72 h時最為明顯，作者對其進行了鑒定和重點研究（圖3C）。為了進一步研究SIRT6在DP巨噬細胞中的可能功能，作者將巨噬細胞標志物CD68和SIRT6共染色，發現DP巨噬細胞中SIRT6的表達與CP相比顯著降低（圖3D）。SIRT6抑制劑顯著降低了巨噬細胞進行胞葬的能力，而SIRT6過表達提高了巨噬細胞吞噬凋亡中性粒細胞的能力（圖3E, F）。綜上所述，高糖刺激導致巨噬細胞SIRT6的低表達，從而損害了胞葬作用。胞葬通過減少死細胞的DAMP釋放和維持生物穩態來抑制炎癥。然而，當糖尿病患者巨噬細胞的胞葬作用受損時，通過損傷相關分子識別模型，包括NETosis和壞死性凋亡在內的促炎溶解細胞死亡，導致巨噬細胞浸潤增加，打破了M1和M2分化的平衡。

圖3 SIRT6顯著調節高糖條件下巨噬細胞的胞葬

4. 骨髓特異性SIRT6敲除會加重牙周炎并損害炎癥消退
       為了探索SIRT6介導的巨噬細胞胞葬在牙周炎中的作用，作者將LysM-Cre小鼠與SIRT6flox/flox小鼠雜交產生mS6KO小鼠。與同窩野生型小鼠骨髓巨噬細胞（BMMs）相比，mS6KO骨髓巨噬細胞吞噬凋亡中性粒細胞的能力下降（圖4A）。采用2月齡mS6KO小鼠及其WT窩代小鼠建立LIP模型和LIP分辨率模型。與WT小鼠相比，CEJ到ABC的距離（圖4B, I）和捕獲陽性破骨細胞在mS6KO小鼠中顯著增加（圖4C, J）。為了研究巨噬細胞胞葬受損是否參與了mS6KO小鼠的持續性骨質流失，通過TUNEL染色評估mS6KO小鼠和WT小鼠牙周組織中凋亡細胞的數量（圖4D），結果顯示，與同窩野生型小鼠相比，mS6KO小鼠牙周組織中Ly6g細胞和凋亡細胞的數量顯著增加（圖4E, L）。SIRT6敲除促進了mS6KO小鼠牙周組織中MPO H3cit的NETosis（圖4F, M）。此外，F4/80 CD86 M1巨噬細胞（圖4G, O）和F4/80 CD206 M2巨噬細胞（圖4H，P）在mS6KO小鼠牙周組織中顯著升高（圖4N），但抗炎F4/80 CD206 M2巨噬細胞在mS6KO小鼠牙周組織中的比例低于WT小鼠（圖4Q）。綜上所述，這些發現表明SIRT6介導的巨噬細胞胞葬與牙周破壞和炎癥消退有關。

圖4 髓細胞特異性SIRT6基因敲除會加重牙周炎并損害炎癥消退

5. SIRT6通過H3K56ac抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇的轉錄
       為了深入了解SIRT6調控巨噬細胞胞葬的詳細機制，作者進一步評估了SIRT6對巨噬細胞中microRNA表達的影響。從SIRT6抑制后的巨噬細胞中分離RNA進行miRNA PCR芯片分析，結果顯示miR-216a-5p-216b-5p-217簇明顯增加，SIRT6表達下調（圖5A, B, C）。最近的研究表明，miR-216/217在動脈粥樣硬化和糖尿病等年齡相關疾病中起關鍵作用。與這些結果一致，作者的數據進一步顯示SIRT6抑制和HG條件下miR-216a-5p-216b-5p-217簇表達增加（圖5D, F），SIRT6過表達下表達降低（圖5E）。為了進一步闡明SIRT6如何抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇的表達，作者通過ChIP-qPCR檢測了巨噬細胞中SIRT6宿主基因MIR217HG啟動子的組蛋白修飾。SIRT6通過催化位點3和9乙酰化的組蛋白H3賴氨酸殘基（H3K9ac和H3K56ac）32的去乙酰化而發揮轉錄共抑制作用。有趣的是，作者發現HG處理僅顯著上調H3K56ac的表達（圖5H）。使用覆蓋miR-216a-5p-216b-5p-217啟動子的7對引物進行檢測，結果顯示HG處理增加了miR-216a-5p-216b-5p-217集群啟動子的H3K56ac水平（圖5I）。作者還進一步證實了SIRT6抑制和HG條件下pri-miR-217簇表達增加（圖5J, L），SIRT6過表達后pri-miR-217簇表達下調（圖5K）。值得注意的是，來自mS6KO小鼠的BMMs表現出增加的pri-miR-217和miR-216a-5p-216b-5p-217簇表達（圖5G, M）。

圖5 SIRT6通過H3K56ac抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇的轉錄

6. SIRT6通過“非規范”微處理器復合物抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇成熟
       典型microRNA的成熟最初是初級microRNA（pri-miR）轉錄物的轉錄，該轉錄物由核糖核酸酶III、Drosha（核糖核酸酶）和DGCR8組成的微處理器復合物鑒定和切割。有報道稱，葡萄糖代謝影響Drosha蛋白的表達，葡萄糖剝奪促進Drosha表達，HG刺激抑制Drosha表達。同樣，作者的結果顯示HG刺激可以抑制巨噬細胞中Drosha蛋白的表達（圖6A）。盡管Drosha降低，但作者發現高葡萄糖導致miR216a-5p-216b-5p-217簇的高表達（圖5F）。為了進一步探索HG條件下miR216a-5p-216b-5p-217簇成熟的機制，作者設計了一種特異性的生物素標記的pri-miR-217探針，在巨噬細胞中進行RNA沉淀實驗，銀染色顯示與pri-miR-217結合的多條蛋白帶富集（圖6B）。同時，蛋白質譜分析顯示hnRNPA2B1在識別蛋白列表中排名靠前，未觀察到Drosha和DGCR8。RIP實驗顯示，與IgG相比，hnRNPA2B1抗體降低了更多的pri-miR-217（圖6C）。據報道，hnRNPA2B1與microRNA微處理器復合物蛋白DGCR8相互作用，通過結合m6A標記初級miRNA轉錄物來切割初級miRNA。內源性hnRNPA2B1蛋白與巨噬細胞中DGCR8和Drosha的共免疫沉淀（Co-IP）表明它們之間存在直接的物理相互作用，hnRNPA2B1與DGCR8結合，而未觀察到Drosha（圖6F）。作者進一步確定DGCR8可以與Drosha結合，這意味著hnRNPA2B1與DGCR8結合以招募Drosha形成微處理器復合物，“非規范”微處理器復合物識別并切割pri-miR-217（圖6E）。Co-IP還顯示SIRT6抑制促進了“非規范”微處理器復合物的形成，SIRT6過表達減少了微處理器復合物（圖6G）。此外，作者進一步發現，高糖增加了與pri-miR-217結合的hnRNPA2B1（圖6D）。Chip的結果也顯示HG處理增加了hnRNPA2B1啟動子的H3K56ac（圖6H）。為了確定HG是否以hnRNPA2B1依賴性方式影響pri-miR-217的加工，作者對巨噬細胞進行了hnRNPA2B1敲低，發現成熟miRNA的水平下降，而pri-miR-217的水平增加（圖6I, J）。FISH染色顯示HG刺激導致細胞核中pri-miR-217的減少，敲低hnRNPA2B1后細胞核中pri-miR-217的積累（圖6K）。這些數據表明SIRT6不僅可以促進pri-miR-217的轉錄，還可以通過促進HG條件下“非規范”微處理器復合物的形成來促進miR216a-5p-216b-5p-217簇的成熟。

圖6 SIRT6通過“非規范”微處理器復合物抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇成熟

7. miR-216a-5p-216b-5p-217簇通過靶向DEL-1和CD36負調節巨噬細胞的胞葬作用
       DEL-1和CD36已被確定為巨噬細胞胞葬和清除炎癥的關鍵調節分子。生物信息學算法（miRwalk）的結果表明，miR-216a-5p-216b-5p-217簇與DEL-1和CD36 mRNA的3'UTR結合（圖7A）。隨后，雙熒光素酶報告基因實驗顯示，miR216a-5p-216b-5p-217簇的共轉染降低了WT-DEL-1-3'UTR和WT-CD36-3'UTR的熒光素酶活性，而Mut-DEL-1-3'UTR和Mut-CD36 -3'UTR的熒光素酶活性不受影響（圖7B）。此外，蛋白質印跡分析顯示，在miR216a-5p-216b-5p-217 mimic處理的巨噬細胞中，DEL-1和CD36的表達降低，而在miR-216b-5p-217 inhibitor處理的巨噬細胞中，DEL-1和CD36的表達升高（圖7C）。免疫熒光也證實了DEL-1和CD36在糖尿病牙周炎中的低表達（圖7D）。miR216a-5p-216b-5p-217簇的過表達降低了巨噬細胞的吞噬能力（圖7E）。在這三種microRNA中，miR-217對巨噬細胞吞噬作用的影響最大。在HG環境下敲低miR-217可以恢復巨噬細胞的胞葬，與重組DEL-1蛋白的作用類似（圖7F）。總體而言，作者的研究結果支持SIRT6通過促進pri-miR-217轉錄和pri-miR“非規范”微處理器復合物的形成負調控miR216a-5p/216b-5p-217簇表達的假設。該microRNA簇通過靶向關鍵的胞葬分子DEL-1和CD36抑制巨噬細胞的胞葬，導致巨噬細胞介導的炎癥消退功能失調。

圖7 miR-216a-5p-216b-5p-217簇通過靶向DEL-1和CD36負性調節巨噬細胞的胞葬

8. antagomir-217的局部給藥促進小鼠DP炎癥的消退
       根據上述功能獲得和功能喪失研究中的吞噬指數觀察，miR-217表現出更好的表型，并被選擇用于體內干預治療。作者在結扎絲后第3、6、9和12天立即將miR-217特異性拮抗劑或scramble（NC）-miR注射到糖尿病小鼠的牙周組織中（圖8A）。在第7天解除結扎后，antagomir-217注射明顯改善了糖尿病小鼠牙周炎癥和骨質丟失（圖8B, C, G, H）。注射antagomir-217后，糖尿病小鼠牙周組織中DEL-1的表達明顯增加（圖8D, I）。注射antagomir-217后，糖尿病小鼠牙周組織中Ly6g中性粒細胞的數量明顯減少（圖8E, J）。注射antagomir-217后，MPO H3cit NET（圖8L）和凋亡細胞的形成明顯減少（圖8F, K）。antagomir-217治療組M2型抗炎巨噬細胞（圖8O）比例較高，而對照組大部分巨噬細胞為M1型巨噬細胞（圖8M, N, P）。總而言之，這些結果表明，通過沉默miR-217抑制SIRT6 / miR216a-5p-216b-5p-217簇/ DEL-1和CD36調節軸可促進巨噬細胞的胞葬以清除凋亡細胞，這意味著該調節軸具有作為糖尿病炎癥解決靶點的潛力。

圖8 antagomir-217的局部給藥促進小鼠DP炎癥的消退

結論：
       綜上所述，作者揭示了SIRT6-miR-216/217軸在糖尿病背景下巨噬細胞胞葬中的重要作用，并概述了通過抑制miR-217來改善炎癥消退和牙周組織修復的方法。這一策略可能與糖尿病和其他慢性炎癥性疾病的管理相關。
參考文獻：
Li B, Xin Z, Gao S, et al. SIRT6-regulated macrophage efferocytosis epigenetically controls inflammation resolution of diabetic periodontitis. Theranostics. 2023 Jan 1;13(1):231-249.