實驗方法：RIP、MeRIP、RNA穩定性檢測、免疫組化、ChIP。

多發性骨髓瘤(MM)是第二常見的血液惡性腫瘤。 m6A是最豐富的RNA修飾。YTHDF2識別含有m6A的RNA并加速降解以調節癌癥進展。然而，YTHDF2在MM中的作用尚不清楚。我們研究了YTHDF2在MM中的表達水平和預后作用，并研究了YTHDF2對MM增殖和細胞周期的影響。結果顯示，YTHDF2在MM中高表達，是MM生存的獨立預后因素。沉默YTHDF2抑制細胞增殖，導致G1/S期細胞周期阻滯。RIP和MeRIP結果顯示，YTHDF2以m6A依賴的方式加速了EGR1 mRNA的降解。此外，在體外和體內，YTHDF2的過表達通過依賴m6A的EGR1降解促進MM生長。此外，EGR1通過激活p21^cip1/waf1轉錄和抑制CDK2-cyclinE1來抑制細胞增殖和延緩細胞周期。EGR1敲低可逆轉YTHDF2敲低后的增殖抑制和細胞周期阻滯。綜上所述，YTHDF2的高表達通過EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-cyclin E1軸介導的細胞周期轉變促進MM細胞增殖，突出了YTHDF2作為MM有效的預后生物標志物和有希望的治療靶點的潛力。

技術路線

結果

1）YTHDF2在MM患者中高表達，且與預后相關

為了探討YTHDF2表達與MM之間的關系，我們對MM的發展進行了全面分析。結果顯示，YTHDF2在MM中的表達明顯高于MGUS和SMM (圖1A)。此外，YTHDF2在PCL中的表達高于MM (圖1B)。此外，在MM患者中，較高的DSS、ISS和R-ISS分期與YTHDF2表達升高相關(圖1C-E)。YTHDF2表達水平較高的MM患者的OS短于YTHDF2表達水平較低的患者(圖1F)。我們進一步將YTHDF2表達與其他獨立預后因素結合起來，并構建了一個Nomogram來計算總積分(圖1G)。校準曲線顯示，預測的1年、2年和3年生存概率與實際生存概率非常吻合(圖1H)。總積分較高的MM患者的OS明顯低于總積分較低的患者(圖1I)。1年、2年和3年生存率的總積分的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.7858、0.7763和0.7629 (圖1J)。接下來，我們檢測了YTHDF2在MM細胞系和患者中的表達。研究結果顯示，與正常質細胞相比，YTHDF2在MM細胞系和患者中的表達水平較高(圖1K、L)。此外，在ISS和R-ISS越晚期的MM患者中，YTHDF2的表達水平也有所升高(圖1M、N)。總之，這些結果表明，YTHDF2可能是預測MM預后的潛在生物標志物。

圖1

2）沉默YTHDF2抑制MM細胞增殖，導致G1/S期細胞周期阻滯

為了進一步探討YTHDF2在MM中的作用，我們使用特異性siRNA下調MM細胞系RPMI-8226和NCI-H929中YTHDF2的表達(圖2A, B)。結果顯示， YTHDF2的下調顯著抑制了細胞活力(圖2C、D)和細胞增殖(圖2E、F)。細胞周期分析進一步揭示，RPMI-8226和NCI-H929中YTHDF2的下調導致G1期細胞增多，S期細胞減少，而G2期細胞無顯著差異，提示可能存在G1/S期阻滯 (圖2G、H)。

圖2

3）YTHDF2以m6A依賴的方式增強EGR1 mRNA的降解

鑒于YTHDF2可以促進含有m6A轉錄本的降解，我們基于GSE47552數據集分析了MM患者相對于健康個體的顯著下調基因。我們將這些下調基因與POSTAR3在線數據庫中YTHDF2的PAR-CLIP-seq結果結合，最終獲得388個基因(圖3A)。接下來，使用在線metscape工具進行GO和途徑富集分析，結果表明，YTHDF2與細胞周期的關系最為密切(圖3B)。在這些與細胞周期相關的基因中，EGR1下調幅度最大，因此選擇EGR1進行進一步驗證。與正常質細胞相比，EGR1在MGUS、SMM和MM中的表達較低(圖3C)。此外，在ISS分期較高的PCL和MM患者以及復發的MM患者中，EGR1的表達顯著降低(圖3D-F)。研究還表明，EGR1低表達的MM患者的OS明顯較差(圖3G)。此外，我們證實了與正常質細胞相比，MM細胞系中的EGR1下調(圖3H)。此外，我們還研究了YTHDF2以m6A依賴的方式調節EGR1表達的能力。結果表明，YTHDF2的下調顯著上調了EGR1的表達(圖3I,3J)。RIP-qPCR驗證了YTHDF2蛋白與EGR1 mRNA的相互作用(圖3K)。在YTHDF2下調的MM細胞中，EGR1 mRNA的半衰期也顯著延長，表明YTHDF2可以降低EGR1 mRNA的穩定性(圖3L)。使用SRAMP發現了EGR1 mRNA的幾個潛在m6A位點(圖3M)，并進行MeRIP-qPCR。敲低YTHDF2顯著增加MM細胞中EGR1 mRNA的m6A修飾(圖3N)。綜上所述，EGR1 mRNA是YTHDF2的直接靶點，YTHDF2可以在MM中以依賴m6A的方式加速EGR1 mRNA的降解。

圖3

4）EGR1通過轉錄調控p21^cip1/waf1抑制細胞增殖，導致細胞周期阻滯

為了進一步驗證EGR1在MM中的作用，我們在MM細胞系中沉默了EGR1(圖4A, B)。EdU實驗顯示，沉默EGR1顯著增強了細胞增殖(圖4C, D)。此外，細胞周期分析顯示，EGR1的下調導致S期細胞增加，G1期細胞減少，提示G1/S期的促進(圖4E, F)。CDKN1A，也被命名為p21^cip1/waf1，是一種被充分研究的腫瘤抑制因子，以介導細胞周期阻滯而聞名。EGR1的敲低顯著降低了p21^cip1/waf1的表達(圖4A, B)。為了進一步評估EGR1是否參與了MM細胞中p21^cip1/waf1的轉錄激活，我們使用JASPAR預測了p21^cip1/waf1啟動子上潛在的EGR1結合基序(圖4G)。ChIP-qPCR檢測證實了EGR1與p21^cip1/waf1啟動子之間的相互作用(圖4H, I)。此外，我們構建了野生型(wt)或突變型(mut)序列的熒光素酶報告質粒，發現在EGR1敲低和YTHDF2過表達時，wt熒光素酶報告質粒中的熒光素酶活性均顯著降低(圖4J)。總的來說，EGR1可以通過轉錄激活p21^cip1/waf1來抑制MM細胞的增殖并延緩細胞周期。

圖4

5）沉默YTHDF2通過EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1軸抑制細胞增殖和細胞周期

先前的研究表明，CDK2-Cyclin E1參與了p21^cip1/waf1介導的G1/S細胞周期轉變。因此，我們推測YTHDF2可以通過MM中的EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1軸調控細胞增殖和細胞周期。正如預期的那樣，在MM細胞系中，YTHDF2敲低后，p21^cip1/waf1表達增加，而CDK2和Cyclin E1表達減少(圖5A)。相反，EGR1的敲低導致p21^cip1/waf1的下調，但導致CDK2和cyclin E1的上調(圖5B)。為了進一步研究YTHDF2/EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2Cyclin E1軸在MM中的作用，我們在MM細胞系中同時沉默YTHDF2和EGR1。EGR1的敲低不僅逆轉了YTHDF2沉默導致的EGR1和p21^cip1/waf1表達的增加，還逆轉了CDK2和Cyclin E1表達的降低(圖5C-E)。此外，細胞周期分析顯示，EGR1敲低顯著逆轉了YTHDF2敲低誘導的G1/S期阻滯(圖5F、G)。EdU實驗顯示，沉默EGR1顯著增強了YTHDF2敲低MM細胞的細胞增殖(圖5H、I)。總體而言，YTHDF2可以通過EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1軸促進MM細胞增殖和G1/S期過渡。

圖5

6）敲低YTHDF2抑制MM異種移植模型中的腫瘤生長

為了評估YTHDF2對MM在體內增殖的影響，我們將轉染shNC或shYTHDF2的RPMI-8226細胞皮下注射到裸鼠體內。shYTHDF2轉染的RPMI-8226細胞的腫瘤比shNC轉染的RPMI-8226細胞的腫瘤在外觀上更小(圖6A, B)。YTHDF2的敲低顯著降低了腫瘤體積(圖C)和腫瘤重量(圖6D)。IHC結果證實，在YTHDF2下調的異種移植物中，YTHDF2、CDK2、Cyclin E1和Ki-67的表達降低，EGR1和p21^cip1/waf1的表達增加(圖6E, F)。綜上所述，這些數據證實了YTHDF2在體內通過EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1軸促進MM增殖的致癌作用。

圖6

7）過表達YTHDF2可促進MM在體內和體外的生長

研究結果進一步表明，通過慢病毒轉導過表達YTHDF2 (LV-oeYTHDF2)可顯著降低EGR1和p21的表達，但增強CDK2和Cyclin E1的表達(圖7A, B)。此外，YTHDF2的上調可顯著促進細胞增殖和細胞周期的進展(圖7C-F)。過表達YTHDF2的MM細胞中EGR1 mRNA的半衰期顯著縮短(圖7G)。MeRIP-qPCR也顯示，過表達YTHDF2顯著降低了EGR1 mRNA的m6A修飾(圖7H)。此外，我們將轉染LV-NC和LV-oeYTHDF2的RPMI-8226細胞皮下注射到裸鼠體內，觀察到LV-oeYTHDF2組的腫瘤比LV-NC組大(圖7I)。此外，YTHDF2的過表達顯著增加腫瘤體積(圖7J)和腫瘤重量(圖7K)。免疫組化結果證實，與LV-NC組相比，LV-oeYTHDF2異種移植物中EGR1和p21^cip1/waf1的表達降低，YTHDF2、CDK2、Cyclin E1和Ki-67的表達增加 (圖7L, M)。

圖7

結論：YTHDF2在MM中是一個獨立的預后因子，可以通過EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1軸促進腫瘤生長和細胞周期轉變，突出表明YTHDF2可以作為預測MM預后的潛在生物標志物和有希望的治療靶點。

參考文獻：Liu R, Miao J, Jia Y, Kong G, Hong F, Li F, Zhai M, Zhang R, Liu J, Xu X, Wang T, Liu H, Hu J, Yang Y, He A. N6-methyladenosine reader YTHDF2 promotes multiple myeloma cell proliferation through EGR1/p21cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1 axis-mediated cell cycle transition. Oncogene. 2023 Apr 3. doi: 10.1038/s41388-023-02675-w.