實驗方法：HLF、Hep3B、SK-Hep1和HEK293 T細胞培養(yǎng)，Sphere Assay，克隆形成實驗，流式細胞術分析，藥物抵抗和IC50，質粒和慢病毒敲低小RNA，考馬斯亮藍染色，質譜，反轉錄PCR，RT-qPCR，免疫印跡，免疫共沉淀（co-IP），谷胱甘肽S轉移酶（GST）pull-down，免疫熒光，共聚焦顯微鏡成像，熒光素酶報告基因實驗，異種移植腫瘤形成，體內藥物治療，RNA-Seq

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是一小群具有干性和多向分化潛能的腫瘤細胞，導致腫瘤進展和治療抵抗。然而，CSCs在肝細胞癌（HCC）中的具體作用機制尚不清楚。作者發(fā)現在晚期HCC組織中，膠原蛋白表達上調，與其受體DDR1的表達一致。因此，高膠原水平伴隨DDR1高表達與HCC患者的不良預后相關。膠原誘導的DDR1活化增強了肝癌細胞在體外和體內的干性。機制上，DDR1與CD44相互作用，CD44作為共受體放大膠原誘導的DDR1信號，膠原- DDR1信號通過促進PP2AA募集到MST1來拮抗Hippo信號，導致YAP活化過度。DDR1和YAP聯合抑制可協同抑制肝癌細胞的體外干性和體內成瘤性。基于T2加權圖像的放射組學模型可以無創(chuàng)預測膠原表達。這些發(fā)現揭示了膠原- DDR1信號抑制Hippo信號的分子基礎，并突出了CD44 / DDR1 / YAP軸在促進癌細胞干性中的作用，提示DDR1和YAP可能作為HCC新的預后生物標志物和治療靶點。

技術路線：

主要研究結果：

1、高膠原蛋白I和DDR1水平預示HCC患者預后不良

為分析HCC腫瘤內膠原的類型，作者對HCC組織進行Picro-Sirius red染色。結果顯示，Ⅰ型膠原占膠原的比例最高（圖1A）。為探索Ⅰ型膠原在HCC中的臨床意義，作者檢測了123例具有相應臨床病理特征的HCC組織芯片中Ⅰ型膠原的表達。與高分化HCC組織相比，Ⅰ型膠原在中分化HCC組織中高表達，在低分化組織中表達最高（圖1B）。Kaplan-Meier分析顯示，腫瘤中Ⅰ型膠原蛋白高表達的患者比Ⅰ型膠原蛋白低表達的患者具有更低的總生存率和更高的復發(fā)率（圖1C）。Tumor sphere-forming assays顯示膠原I促進HCC細胞干性的能力（圖1D）。

為檢測DDR1在HCC中的臨床意義，作者分析了相同組織芯片和TCGA數據庫中DDR1的水平。結果表明DDR1與Ⅰ型膠原呈正相關（圖1E-F）。根據Ⅰ型膠原和DDR1表達情況，將患者分為三組Col1⁺DDR1⁺（n?=?54）、Ⅰ型膠原/DDR1雙高表達；Col1⁺DDR1^-或Col1^-DDR1⁺（n?=?33），Ⅰ型膠原或DDR1單高表達；Col1^-DDR1^-（n?=?36），Ⅰ型膠原/DDR1雙低表達。與其他組相比，Col1⁺DDR1⁺組的總生存時間和無病生存時間最短（圖1G）。總之，臨床樣本中Ⅰ型膠原和DDR1之間的關系表明，在HCC患者中，Ⅰ型膠原和DDR1的協同作用導致了較差的臨床結果，可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

圖1 I型膠原和DDR1在臨床肝癌患者中的臨床意義

2、膠原I-DDR1信號增強腫瘤干細胞特征

為驗證體外DDR1對肝癌細胞干性的影響，作者進行sphere-forming assays。結果發(fā)現，與相應培養(yǎng)的貼壁細胞（non-CSCs）相比，DDR1蛋白水平在HCC球（CSCs）中顯著上調（圖2A）。DDR1作為維持干細胞自我更新潛能的關鍵轉錄因子和膜蛋白，過表達DDR1促進SOX2、NANOG和EPCAM的mRNA表達。I型膠原刺激進一步放大了這種效應。然而，過表達DDR1激酶死亡突變體（DDR1-K618A）和膠原結合缺陷突變體（DDR1-R105A）并沒有達到這種效果。TCGA數據庫中DDR1表達與CD133呈正相關，組織芯片的IHC驗證了這一點（圖2B-C）。此外，DDR1過表達或I型膠原刺激誘導球形成效率、CD133陽性細胞數、單細胞克隆形成和對sorafenib或doxorubicin的耐藥性顯著增加。相反，過表達DDR1-K618A和DDR1-R105A突變體未能表現出相同的結果。相比之下，DDR1缺失顯著降低了這些CSC相關的生物學效應（圖2D-G）。

在體內，作者使用異種移植模型來檢測DDR1在肝癌細胞中的作用。DDR1敲低成球細胞形成的皮下瘤明顯小于scramble細胞形成的皮下瘤（圖3A）。IHC結果顯示DDR1、Ki67和CD133的蛋白水平在亂序腫瘤中高于DDR1敲低腫瘤（圖3B）。為進一步研究DDR1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，作者通過皮下注射NOD/SCID小鼠細胞，在NOD/SCID小鼠細胞中加入或不加入上調的DDR1細胞進行有限稀釋實驗。DDR1過表達顯著增強腫瘤形成能力，增加干細胞頻率（圖3C-E）。上述研究表明DDR1在體外和體內促進肝癌細胞干性和腫瘤發(fā)生，依賴于其激酶活性和膠原刺激。

圖2 DDR1在體外增強HCC細胞系的干性

圖3 DDR1在體內增強HCC細胞系的干性

3、膠原誘導的DDR1激活是由CD44協同促進的

為研究DDR1在肝細胞癌中的分子機制，作者使用IP/MS方法研究了其相互作用的伙伴。用FLAG-DDR1或FLAG-vector轉染SK-Hep1細胞，用抗FLAG抗體免疫沉淀。作者發(fā)現CD44（CSCs標記物）是DDR1潛在的相互作用蛋白之一（圖4A）。免疫共沉淀（Co-IP）和谷胱甘肽S -轉移酶（GST） pull-down實驗實驗結果表明DDR1與CD44存在相互作用和結合（圖4B-C）。此外，免疫熒光和激光共聚焦檢測外源性DDR1和CD44在293T細胞中的空間共定位。在HLF細胞中觀察到類似的內源性DDR1和CD44表達（圖4D）。隨后，作者進行了有/無I型膠原蛋白激活的co-IP實驗，發(fā)現膠原蛋白I增加DDR1與CD44的相互作用（圖4E）。由于CD44可以作為輔助受體介導受體內化、激活、降解或調節(jié)受體激酶活性，作者推測CD44是否可以調節(jié)I型膠原誘導的DDR1活化。Co-IP實驗表明，CD44敲低降低了DDR1的酪氨酸磷酸化（圖4F）。過表達CD44以時間依賴的方式促進Ⅰ型膠原誘導的DDR1的磷酸化。在HLF細胞中敲低DDR1則減弱這種作用（圖4G）。結果提示CD44促進Ⅰ型膠原誘導的肝癌細胞DDR1的活化。CD44在肝癌中的功能是否依賴于DDR1，作者在CD44過表達的HLF細胞中敲低DDR1，在CD44敲低的Hep3B細胞中過表達DDR1。DDR1敲除部分降低了肝癌細胞的成球率、單細胞克隆形成率、CD133陽性的干細胞樣細胞比例以及CD44過表達導致的化療耐藥。DDR1的過表達部分增強了I型膠原內CD44缺失所降低的CSCs特性（圖5A-D）。CD44過表達細胞形成的皮下腫瘤的體積和重量明顯大于空載體或CD44/shDDR1細胞形成的皮下腫瘤（圖5E）。以上證據表明DDR1是CD44介導的肝癌細胞干性信號所必需的關鍵蛋白。

圖4 CD44與DDR1相互作用，促進DDR1磷酸化

圖5 體內外CD44與DDR1的交互作用增強了HCC細胞系的干細胞性

4、DDR1通過促進PP2AA募集到MST1/2而使Hippo信號失活

為確定DDR1影響HCC細胞干性的途徑，作者對DDR1敲低的HCC細胞和對照細胞進行了RNA測序。KEGG通路分析發(fā)現DDR1缺失顯著改變了Hippo信號通路（圖6A）。基于TCGA數據庫，DDR1與YAP、CTGF、BCL2、AXL呈正相關。Hippo信號與腫瘤干性密切相關，作者檢測了DDR1對YAP/TAZ（Hippo通路核心蛋白）下游基因表達的影響。結果顯示，在Hep3B細胞中過表達DDR1后，CTGF、CYR61、BCL2和AXL的mRNA水平上調。膠原蛋白I的存在進一步增強了這些作用。相反，DDR1敲低顯著降低CTGF、CYR61、BCL2和AXL的表達（圖6B）。雙熒光素酶報告實驗提示DDR1增強了Ⅰ型膠原中YAP/TEAD反應元件的活性（圖6C）。核質分離和免疫熒光實驗表明，DDR1過表達促進YAP易位進入細胞核（圖6D-E）。Western blotting顯示，I型膠原刺激的DDR1磷酸化降低了MST1磷酸化，增強了YAP的激活，而DDR1敲除則表現出相反的效果（圖6F）。這些結果表明膠原I-DDR1信號通路可誘導YAP活化。

protein phosphatase 2 scaffold subunit A alpha（PP2AA; PPP2R1A）作為經典的上游磷酸酶，可以使MST1/2去磷酸化，從而使Hippo信號通路失活。作者分析了與DDR1相互作用的蛋白。PP2AA是DDR1潛在的相互作用蛋白（圖4A）。募集實驗表明DDR1以膠原依賴的方式促進PP2AA向MST1的募集（圖6G）。PP2AA缺失減弱了膠原IDDR1信號誘導的MST1和LAST1去磷酸化，導致YAP激活（圖6H）。這些結果表明，PP2AA是膠原I-DDR1信號誘導YAP活化所必需的。

在臨床樣本中，作者評估了39例HCC患者組織樣本中p-DDR1、CD44和YAP蛋白水平。結果顯示，肝癌組織中p-DDR1、CD44和YAP水平呈正相關（圖6I）。基于I型膠原的IHC染色，將樣本分為I型膠原陽性（Ⅰ型膠原⁺）和I型膠原陰性（Ⅰ型膠原^-）表達組。作者隨后進行了多色免疫熒光（IF）來分析這三種蛋白的共定位（圖6J）。如上所述，在I型膠原沉積過程中，p-DDR1和CD44水平與YAP的表達密切相關。

圖6 DDR1通過滅活YAP阻礙Hippo信號傳導

5、聯合抑制DDR1和YAP在肝癌細胞干性中具有協同作用

為驗證DDR1是否通過YAP發(fā)揮作用，作者使用DDR1抑制劑（7rh）和YAP抑制劑（verteporfin; VP）進行體外和體內實驗。7rh是一種ATP競爭性口服DDR1特異性小分子抑制劑。Verteporfin（VP）是YAP/TAZ的抑制劑，在FDA批準的小分子化合物庫中被鑒定，并被報道在空間上阻礙YAP和TEAD之間的相互作用。單獨使用7rh或VP處理分別減少了成球效率、克隆形成和CD133?^+?細胞比例的細胞數量，并減少了移植瘤的體積和重量。與單藥相比，7rh和VP聯合處理進一步減弱了這些效應（圖7A-D）。IHC結果顯示，與7rh或VP處理的腫瘤相比，Ki67和CD133在scrambled腫瘤中染色更強烈。聯合組腫瘤中Ki67和CD133表達最低（圖7E），聯合治療顯示出良好的抗腫瘤治療效果。

圖7 DDR1和YAP信號共同抑制體外和體內腫瘤增殖

6、臨床放射組學預測模型

在組織芯片的患者中，作者獲得了92張T2WI圖像，共有65例患者最終納入本次回顧性研究。預測模型依賴于Ⅰ型膠原IHC評分。將患者分為高、低兩組。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析評估模型性能。結果顯示，基于14個特征的模型在驗證數據集上獲得了最高的AUC（圖8A）。此時，對于測試數據集，模型的AUC和預測精度分別為0.717和0.700。臨床診斷統(tǒng)計及所選特征見圖8B。

圖8 預測膠原I表達的放射組學模型

結論

總之，本研究結果表明，CD44介導的膠原I-DDR1信號作為腫瘤激勵因子，通過募集PP2AA激活YAP來促進HCC細胞的干細胞性。在HCC組織中，膠原I和DDR1表達的增加預示著預后不良，因此可以作為HCC有希望的生物標志物和新的治療策略。

參考文獻

Xiong YX, Zhang XC, Zhu JH, Zhang YX, Pan YL, Wu Y, Zhao JP, Liu JJ, Lu YX, Liang HF, Zhang ZG, Zhang WG.（2023）. Collagen I-DDR1 signaling promotes hepatocellular carcinoma cell stemness via Hippo signaling repression. Cell Death Differ. doi: 10.1038/s41418-023-01166-5.