實驗方法：免疫組化，RT-qPCR，WB，小鼠模型，譜系追蹤測定，腫瘤類器官，流式分選，細胞共培養，Treg抑制實驗，RNA測序，單細胞RNA測序及其生信分析

最新研究發現了一種獨特的癌癥相關成纖維細胞（CAF）群體，稱為抗原呈遞CAFs（apCAFs），其特征是主要MHC II類分子的表達，表明其具有調節腫瘤免疫方面的功能。本研究通過整合多項單細胞RNA測序和進行穩健的譜系追蹤分析，發現apCAFs來源于間皮細胞；在胰管腺癌（PDA）進展過程中，間皮細胞通過下調間皮特征并獲得成纖維細胞特征形成apCAFs，這一過程由IL-1和TGF-β誘導；apCAFs以抗原特異性方式直接連接并誘導初始CD4+ T細胞分化為調節性T細胞（Tregs）；靶向間皮細胞標志物mesothelin可有效抑制間皮細胞向apCAF轉化和apCAF誘導的Treg形成。

技術路線：

主要實驗結果：

1、apCAFs來源于間皮細胞

作者之前通過scRNA-seq分析了多種PDA的基因工程小鼠模型（GEMMs）（正常胰腺、早期KIC、晚期KIC、晚期KPC和晚期KPfC [Kras^LSL-G12D/+; Trp53 ^fl/fl; Pdx1^Cre/+]），并確定了正常胰腺和早期PDA中的三個成纖維細胞群（FB1、FB2和FB3）以及后期PDA中的兩個群（FB1和FB3）。為了解成纖維細胞在這些模型之間的關系，將來自正常胰腺、早期KIC、晚期KIC、晚期KPC和晚期KPfC的所有成纖維細胞投影到tSNE圖上，并進行聚類（圖1A），并鑒定到成纖維細胞的四種分子亞型（圖1B），其中FB1和FB2在此前的報道中已有描述，但此前鑒定的FB3亞群在這里聚為了3類，所以命名為FB3和FB3B，其中FB3B在所有晚期GEMMs中都有特異性擴增（圖1C）。然后研究FB3A和FB3B的轉錄譜，發現每個亞型都以MHC II通路和間皮細胞基因的表達為特征（圖1D-1E）。但與FB3A相比，FB3B的間皮標志基因表達水平較低，炎癥和肌纖維母細胞性基因表達水平升高（圖1D，1F）。這些數據表明FB3A和FB3B為間皮細胞，FB3A為正常間皮細胞，FB3B為成纖維表型的間皮細胞。

為了解這些間皮細胞相關群體之間的關系，作者整合了三個成纖維細胞數據集，并使用UMAP進行聚類和降維，結果顯示來成纖維細胞分為11個不同的集群（圖1G）。為識別間皮細胞簇，生成MHC II通路和間皮細胞基因的UMAP圖，發現聚類7和9表達這些特征基因（圖1H）。根據數據集的來源強調成纖維細胞的分布，以了解FB3A、FB3B、apCAFs和正常間皮細胞之間的關系（圖1I）。發現合并數據中的聚類7（圖1G）具有與FB3A相同的特征，聚類9與FB3A相同，提示簇7代表正常間皮細胞，簇9代表成纖維細胞間皮細胞群。因此，本研究中將簇9定義為apCAFs，簇7定義為正常間皮細胞。

圖1 scRNA-seq綜合分析正常間皮細胞與apCAFs的關系

2、在PDA進展過程中，間皮細胞擴張并促進粘連形成

收集3只KPfC小鼠的晚期腫瘤（PDA1、PDA2、PDA3），消化成單細胞懸液，分析apCAFs的比例（圖2A），發現所有三種腫瘤都由apCAFs組成，其百分比與iCAFs和myCAFs相當。為追蹤PDA進展過程中間皮細胞的命運，作者使用CFSE燃料進行譜系追蹤測定，將CFSE注射到野生型小鼠的腹腔內，并在2天后獲取胰腺，發現正常胰腺的間皮被細胞示蹤染料標記（圖2B），相反，在60天大的KIC或KPfC荷瘤小鼠身上進行了同樣的檢測，并且發現CFSE標記的細胞從間皮區域滲入到腫瘤基質中（圖2B）。為確保CFSE信號是間皮細胞特異性的，將CFSE標記的組織與cadherin-11共同染色（圖2C），發現在正常的胰腺和PDA中，CFSE+細胞也是cadherin-11+；此外，與胰腺癌細胞標志物SOX9共同染色，發現CFSE+的細胞與SOX9+的癌細胞不同（圖2C），進一步支持CFSE信號對間質細胞的特異性。

鑒于在胚胎發育過程中，間皮細胞可以分化為成纖維細胞和平滑肌細胞，所以作者用正常的間皮細胞（簇7）、apCAF（簇9）和其他密切相關的成纖維細胞群（集群1、4、8和10）進行偽時間分析，發現盡管正常的間皮細胞在成為apCAF時獲得了成纖維細胞的特征并趨向于成纖維細胞，但它們對其他CAF群體的形成貢獻有限（圖2D），這支持iCAF和myCAF系來自常駐成纖維細胞。由于apCAFs通過下調間皮細胞基因和上調成纖維細胞基因獲得了差異基因標簽（圖2E），所以對apCAFs中上調的基因進行通路和功能富集分析，以確定驅動這種基因特征變化的生物學過程，結果發現許多已識別的生物過程與損傷或炎癥反應有關（圖2F），這表明來自腫瘤小生境的創傷相關信號可以誘導apCAF的形成。

圖2 間皮細胞在PDA形成過程中擴增并獲得成纖維細胞特征

3、創傷相關腫瘤旁分泌信號誘導間皮細胞—apCAF轉變

為驗證間皮細胞—apCAF的轉化，以及在PDA進展過程中確定間皮細胞的命運，利用一個由間皮細胞特異性基因Wt1啟動子驅動的可誘導Cre-loxP系統構建Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato模型（圖3A）。Wt1^CreERT2/+;R26^{LSL-tdTomato/+}小鼠在Wt1基因位點表達Cre-ERT2融合蛋白。CreERT2在他莫昔芬（TAM）處理后會從R26位點切除LSL序列，這將不可逆地誘導tdTomato表達。將TAM注射入Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato模型小鼠并收集胰腺（圖3B）。結果顯示正常胰腺間皮表達tdTomato（圖3C-3D）。作為陰性對照，R26^LSL-tdTomato小鼠沒有Wt1^CreERT2不表達tdTomato（圖3E）。接下來，追蹤PDA進展過程中間皮細胞的命運。將Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato小鼠胰腺內的間皮細胞標記為tdTomato+，原位注射源自KPfC小鼠的同基因PDA細胞系，在植入后3周收獲成熟腫瘤（圖3B），發現間皮細胞在PDA中大量擴增，tdTomato+細胞分布在腫瘤周圍和內部（圖3F-H）。此外，在正常胰腺中，間皮細胞不表達成纖維細胞標志物，如aSMA和IL-6（圖3C-3D），而PDA內可見tdTomato+aSMA+（圖3F）或tdTomato+IL-6+（圖3G）細胞。間皮譜系追蹤實驗強有力的證明間皮細胞獲得成纖維細胞特征，并有助于PDA的間質形成。

圖3 PDA中間皮細胞的譜系示蹤與可誘導轉基因小鼠模型

4、間皮細胞系再現間皮細胞—apCAF轉變

為研究腫瘤旁分泌信號是否能誘導間皮細胞分化為apCAFs，建立小鼠胰腺間皮細胞系。將間皮外植體接種到組織培養皿中，接種后5天，細胞開始從間皮遷移（圖4A）。一旦融合，這些細胞進行流式細胞術，其中95%的細胞為podoplanin和MHC II雙陽細胞（圖4A），將這些細胞命名為胰腺間皮細胞（PanMeso）。對第10-20代PanMeso細胞進行轉錄組分析，發現其具有穩定的間皮基因標簽和低表達的成纖維細胞基因（圖4B）。用KPfC PDA類器官條件培養（CM）基處理PanMeso細胞，發現其顯著降低間皮細胞基因的表達（圖4C）。對差異上調的基因進行功能富集分析，發現其主要參與傷口和炎癥響應（圖4D），這與單細胞測序結果一致。進一步對腫瘤進行eGFP和aSMA或IL-6的IHC染色，發現TME誘導eGFP+ PanMeso細胞表達aSMA和IL-6（圖4E和4F）。綜上所述，使用PanMeso細胞的體外數據再現了間皮細胞的成纖維細胞轉化，并強調了腫瘤旁分泌信號在促進這一過程中的重要性。

圖4 PanMeso細胞中間皮細胞- apCAF轉變的概述

5、apCAFs誘導幼稚CD4+ T細胞轉變為Tregs細胞

采用圖5A中的方案對KPfC腫瘤進行流式細胞術分選，對分選的細胞進行OVA處理，然后和CD4+ T細胞共培養。結果顯示正常間皮細胞和apCAFs能以OVA依賴的方式誘導T細胞擴增早期激活標志物CD25和CD69的表達，而iCAFs和myCAFs則不能（圖5B-C）。隨后使用PanMeso細胞重復上述實驗（圖5A），PDA類器官CM誘導的apCAFs形成導致PanMeso細胞的抗原提呈能力增加（圖5B-C）。

隨后為探究apCAFs是否誘導Treg細胞形成，檢測和OVA處理的apCAFs細胞共培養的CD4+ T細胞的Treg細胞的存在，結果顯示apCAFs以抗原特異性的方式誘導Treg的形成（圖5D-E）。進一步檢測apCAFs誘導形成的Tregs細胞的免疫抑制功能，如圖5F-G所示，其顯著抑制CD8+ T細胞的增殖。綜上所述，這些數據表明apCAFs可能是一個獨特的免疫調節CAF群體，可以通過抗原依賴的TCR連接誘導Treg的形成和擴增。

圖5 apCAFs誘導幼稚CD4 + T細胞進入Tregs

6、apCAFs存在于人類腫瘤中并與Tregs相關

為證明apCAFs與人類的相關性，收集人PDA腫瘤組織并進行多色免疫熒光觀察apCAFs與Tregs。PDGFRa在除了間質細胞外的所有CAF類群中表達，所以PDGFRa⁺CD74⁺特異性標記apCAFs，PDGFRa⁺CD74^—標記其余類型CAFs（圖6A）。結果顯示，在人PDA中，apCAFs豐度具有異質性（圖6B），并且與Tregs具有相關性，與其它CAF無相關性（圖6C-D）。此外，作者使用上述小鼠apCAFs基因特征表征了兩個人PDA和卵巢癌的單細胞數據集，發現兩者間有重疊（圖6F-G）。因此，以上表明在人腫瘤中也存在apCAFs并與Tregs相關。

圖6 apCAFs存在于人類腫瘤中，并與Treg相關

7、IL-1和TGF-β參與間皮細胞—apCAF轉化

為確定驅動間皮細胞向apCAF轉化的信號通路，提取在apCAF中上調的差異基因，并對它們進行motif富集分析，鑒定到NF-kB通路的Nfkb1和Rela，TGF-β信號通路的Smad1，Smad3，Smad4（圖7A）。IL-1誘導的NF-kB信號通路被預測負責iCAF譜系的形成，而TGFβ被預測驅動myCAF譜系。為驗證這一結果，使用PDA類器官CM處理PanMeso細胞，結果顯示NF-kB和TGF-β信號通路均被激活了（圖7B）。隨后檢測IL-1和TGFβ是否驅動間皮細胞的apCAF表型，結果顯示，與對照組比較，IL-1和TGFβ處理的PanMeso細胞中間質細胞基因的表達顯著下降（圖7C），相反成纖維細胞相關基因顯著上調表達（圖7D）。這些結果表明IL-1和TGFβ可以驅動間皮細胞向apCAF表型轉化。

接下來探究IL-1和TGFβ是否影響間皮細胞的功能。結果顯示OVA特異性TCR激活被IL-1和/或TGFβ預處理的PanMeso細胞增強（圖7E-7F）。此外，IL-1和/或TGFβ預處理的PanMeso細胞顯著增強Treg細胞數量（圖7G-7H）。以上數據表明，IL-1/NF-kB和TGFb信號通路負責正常間皮細胞分化為apCAFs，并具有活化CD4+ T細胞和促進其分化為Treg的能力。

圖7 IL-1和TGF-β參與間皮細胞—apCAF轉化

8、靶向間皮素可抑制間皮細胞向apCADs轉化

有兩篇報道使用小鼠特異性阻斷單克隆抗體（mAb）對抗間皮細胞標記物間皮素（MSLN Ab）來抑制間皮細胞向成纖維細胞的轉變。因此，作者測試了mAb對間皮細胞apCAF形成的影響。使用PDA類器官CM、對照Ab、MSLN Ab處理PanMeso細胞，結果顯示MSLN Ab顯著抑制由PDA類器官CM引起的間質基因的下調和EMT及成纖維細胞基因的上調（圖8A）。在小鼠體內，MSLN Ab顯著減少TAM誘導的Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato小鼠的tdTomato陽性細胞（圖8B-C）、tdTomato+aSMA/IL6+雙陽性細胞（圖8D-E）。

功能實驗顯示，MSLN Ab可抑制因PanMeso細胞的PDA類器官CM引起的抗原呈遞和Treg細胞誘導能力（圖8F-I）。重要的是，MSLN Ab可抑制腫瘤生長和腫瘤中Treg細胞比例（圖8J-M）。綜上所述，以上表明靶向MSLN可能是有效抑制間皮細胞向apCAF轉化和克服apCAF誘導的免疫抑制的潛在策略。

圖8靶向間皮素可抑制間皮細胞向apCADs轉化

參考文獻：

Huang H, Wang Z, Zhang Y, Pradhan RN, Ganguly D, Chandra R, Murimwa G, Wright S, Gu X, Maddipati R, Müller S, Turley SJ, Brekken RA. Mesothelial cell-derived antigen-presenting cancer-associated fibroblasts induce expansion of regulatory T cells in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2022 Jun 13;40(6):656-673.e7. doi: 10.1016/j.ccell.2022.04.011. Epub 2022 May 5. PMID: 35523176; PMCID: PMC9197998.