動物實驗，細胞增殖測定，酶聯免疫吸附，蛋白質陣列，免疫印跡，免疫熒光，定量 RT-PCR，HE染色，流式細胞術，活體成像

胰腺癌（PAAD）是2020年男性和女性第7大死亡原因，死亡率/發病率極高。由于缺乏早期癥狀和異常侵襲性的發展，其5年生存率仍然不令人滿意。手術切除是目前唯一的根治性治療方案，但患者確診時通常已處于晚期并有遠處轉移，因此無法治愈。為改善患者預后，目前已采用吉西他濱和5-氟尿嘧啶等新輔助或輔助化療，或靶向藥物厄洛替尼和奧拉帕利，然而治療結果不令人滿意。據報道，由腫瘤微環境調節的成纖維細胞和免疫細胞由于其免疫抑制和治療抵抗的特性，與PAAD的不良預后相關。然而，適應性免疫人群的研究進展令人失望，迫切需要將研究重點轉向其他類型的細胞，特別是髓樣細胞。褪黑素是一種調節晝夜節律的天然激素，在大腦的松果體中合成。褪黑素還參與免疫反應和抗炎作用，具有抗腫瘤特性。然而，褪黑素在介導腫瘤免疫應答中的作用尚不清楚。

技術路線：

圖形摘要：

主要研究結果：

1. 褪黑素表達降低與PAAD患者不良預后相關

雖然多項體外研究揭示了褪黑素對永生化PAAD細胞系的抑制作用，但褪黑素在PAAD患者腫瘤組織中的內源性表達及其臨床意義仍有待揭示。作者通過免疫組化方法檢測了90例PAAD標本和鄰近胰腺組織褪黑素的表達（圖1A）。與配對的正常鄰近組織相比，PAAD腫瘤中褪黑素的存在顯著減少（圖1B）。值得注意的是，胰腺組織中的褪黑素水平與PAAD患者的OS直接相關，其中這種關聯在腫瘤組織中具有統計學意義，而在癌旁組織中無統計學意義（圖1C、D）。

有趣的是，褪黑素水平與腫瘤進展標志物KI67和P53無關（圖1E、F），這表明褪黑素的減少可能不是由高度增殖的腫瘤細胞引起的。因此，橋接褪黑素減少和不良預后的機制可能更為復雜。將患者按性別分層時，PAAD和癌旁組織中褪黑素的相對水平并沒有顯示出偏倚差異（圖1G）。另一方面，研究報道血漿褪黑素水平隨著年齡的增長而下降。它是許多衰老相關疾病的病因，包括阿爾茨海默病和帕金森病。有趣的是，作者的組織陣列染色結果顯示，PAAD中的褪黑素表達與患者的年齡無關，但在胰腺的鄰近組織中觀察到這一關聯（圖1H）。提示胰腺腫瘤組織褪黑素生成減少提示PAAD患者預后不良。

圖1 胰腺褪黑素水平降低與PAAD患者較短的生存期相關

2. 補充褪黑素可抑制PAAD的腫瘤進展

越來越多的證據表明，褪黑素可能抑制多種人類癌癥的腫瘤進展。為了了解其在PAAD中的作用，作者首先通過胰腺注射小鼠PAAD細胞系Panc02建立了小鼠原位PAAD模型。為了確定胰腺褪黑素在PAAD進展中的作用，作者每天通過灌胃給PAAD小鼠補充飲食褪黑素。口服褪黑素治療顯著增加了PAAD小鼠胰腺中的褪黑素水平（圖2A），并以劑量依賴性方式延緩腫瘤生長（圖2B、C）。為了進一步測量褪黑素的抗腫瘤作用是否與PAAD中的褪黑素信號有關，在褪黑素受體拮抗劑luzindole存在的情況下給予治療劑量的褪黑素。luzindole對褪黑素受體活性的抑制作用完全阻斷了褪黑素對小鼠腫瘤進展和PAAD大小的抑制作用(圖2D、E)。在使用另一鼠PAAD細胞系KPCY和人SW1990細胞系在裸鼠中的重復模型中，結果一致（圖2F、G）。這些發現表明胰腺褪黑素的存在通過其信號通路限制了PAAD的腫瘤進展。

圖2 胰腺褪黑素抑制PAAD的腫瘤發展

3. 褪黑素誘導胰腺中CD11bLy6G中性粒細胞樣細胞的豐度

褪黑素在多種癌細胞中都有抑制癌細胞生長的報道。為了說明作者在體內觀察到的褪黑素對PAAD腫瘤的抑制是否歸因于其對PAAD細胞的活性的直接抑制，作者在體外用不同劑量的褪黑素培養Panc02細胞。作者確定了褪黑素治療是否可以改變小鼠PAAD微環境的免疫特征。通過測量循環和胰腺腫瘤中的CD11bF4/80巨噬細胞、CD11bLy6G粒細胞、CD11bCD11c樹突狀細胞、CD3CD4輔助性T細胞、CD3CD8細胞毒性T細胞以及B220 B淋巴細胞的數量，作者發現補充褪黑素特異性地增加了胰腺腫瘤內的CD11bLy6G細胞的數量（圖3A）。體內注射BrdU證實褪黑素誘導的CD11bLy6G群體在腫瘤微環境中幾乎不增殖（圖3B）。由于中性粒細胞和髓源性抑制細胞（MDSCs）都具有CD11b和Ly6G的細胞標記，但在腫瘤微環境中發揮不同的功能，作者進一步研究了褪黑素誘導的CD11bLy6G細胞在PAAD腫瘤微環境中的特異性表型。從褪黑素處理的PAAD中分選出CD11bLy6G細胞，he染色觀察細胞形態。與骨髓來源單核細胞GM-CSF和IL-6誘導的典型MDSCs相比，褪黑素誘導的PAAD腫瘤CD11bLy6G細胞呈中性粒細胞樣形態（圖3C）。在分選的CD11bLy6G細胞中增加的TNFα表達也提示這個群體比MDSCs更傾向于中性粒細胞（圖3D）。此外，分選的CD11bLy6G細胞不抑制CD8細胞毒性T細胞的增殖或活化T細胞標志物KI67、顆粒酶B（圖3F、G）的表達。這些結果表明，補充褪黑素顯著誘導PAAD腫瘤微環境中的中性粒細胞豐度。

圖3 褪黑素增加體內胰腺腫瘤的中性粒細胞群

4. 褪黑素誘導的腫瘤微環境中性粒細胞參與了PAAD的腫瘤抑制作用

為了進一步確定中性粒細胞在介導褪黑素對PAAD進展的抑制作用中的作用，作者使用了一種針對Ly6G的特異性抗體來去除腫瘤微環境中的CD11bLy6G中性粒細胞。腹腔內注射抗ly6g抗體可有效減少褪黑素處理的PAAD中CD11bLy6G細胞的存在（圖4）。清除CD11bLy6G中性粒細胞顯著減弱褪黑素對PAAD進展的抑制作用（圖4B）和實驗終點的腫瘤大小（圖4C）。然后，作者從接受或未接受褪黑素治療的小鼠的PAAD腫瘤中分選了CD11bLy6G中性粒細胞。褪黑素處理的PAAD小鼠的CD11bLy6G中性粒細胞混合培養顯著誘導Panc02細胞凋亡（圖4D）。相反，在Transwell系統中，CD11bLy6G中性粒細胞不能誘導PAAD細胞凋亡（圖4E），表明褪黑素誘導的CD11bLy6G中性粒細胞通過直接細胞-細胞接觸機制發揮抗腫瘤作用。從褪黑素處理的PAAD小鼠分選出的CD11bLy6G中性粒細胞顯示出比來自溶劑處理的PAAD小鼠的更高的細胞質ROS水平（圖4F）。在褪黑素處理的PAAD的中性粒細胞中，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和NAPDH氧化酶2（NOX2）的表達得到了一致的誘導（圖4G）。此外，正如瓜氨酸化組蛋白H3（H3Cit）和髓過氧化物酶（MPO）染色增加所示，褪黑素處理誘導了PAAD腫瘤微環境中更高水平的中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）（圖4H）。這些結果表明，TME中的CD11bLy6G中性粒細胞通過誘導ROS依賴的NETs發揮褪黑素在PAAD中的抗腫瘤凋亡作用。

圖4 中性粒細胞通過細胞-細胞接觸促進褪黑素誘導的抗腫瘤作用

5. 腫瘤細胞來源的CXCL2招募抗腫瘤中性粒細胞進入褪黑素處理的PAAD微環境

中性粒細胞在腫瘤微環境中既不是增殖性群體，也不是局部群體，主要是通過其前體在循環系統中的募集和成熟。為了確認褪黑素治療是否與PAAD小鼠的中性粒細胞遷移和浸潤相關，作者用PKH26染色分選的中性粒細胞。作者通過腹腔注射給予或不給予褪黑素干預的PAAD小鼠重新補充它們。在褪黑素處理的PAAD小鼠的腫瘤中檢測到較高數量的PKH26CD11bLy6G中性粒細胞（圖5A），證實褪黑素治療誘導中性粒細胞浸潤到PAAD的腫瘤微環境中。為了評估褪黑素對中性粒細胞的這種作用是否是直接的，作者將褪黑素添加到TCDS誘導的來自骨髓分離株的中性粒細胞中。作者注意到，在TCDS中補充褪黑素對誘導TCDS誘導的中性粒細胞遷移或成熟的影響很小（圖5B、C）。同時，從褪黑素處理的Panc02細胞收集的上清液誘導的中性粒細胞顯示出顯著較高的CD11bLy6G細胞群豐度和運動能力（圖5D、E）。這一觀察結果表明，褪黑素不是直接調節中性粒細胞的細胞活性，而是觸發腫瘤細胞獲得中性粒細胞遷移和成熟所需的因子。蛋白質芯片檢測上清液中腫瘤細胞來源的細胞因子和趨化因子的表達變化。與溶劑處理的腫瘤細胞相比，含褪黑素的Panc02細胞釋放了不同的細胞因子和趨化因子譜（圖5F）。一些趨化因子，包括CXCL2、皮膚T細胞吸引趨化因子（CTACK）和p-選擇素，在褪黑素處理后表現出顯著的表達變化（圖5G）。CXCL2已被證明是中性粒細胞在各種生理和病理條件下的趨化劑。與正常鄰近組織相比，人PAAD中的Cxcl2表達顯著降低（圖5H），而在褪黑素處理的小鼠胰腺中觀察到Cxcl2增加（圖5I）。通過流式細胞術檢測MT1和MT2在不同細胞上的表達，探討褪黑素誘導的CXCL2升高是否僅來自于腫瘤細胞。有趣的是，作者觀察到，在腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞（TANs）中，褪黑素處理后MT1和MT2水平顯著增加，而TANs保持不變（圖5J）。為了確定CXCL2水平升高的來源，作者使用細胞內染色來確認CXCL2水平的升高主要來自腫瘤細胞，而不是TAMs，TAMs是一種釋放相同細胞因子的已知免疫細胞（圖5K）。此外，褪黑素處理以劑量和時間依賴性誘導CXCL2的轉錄和蛋白表達（圖5L）。隨后，作者建立了Cxcl2穩定敲低的Panc02細胞（圖5M）。使用MOCK和cxcl2敲低（CXCL2KD）Panc02細胞的上清液（經過或未經過褪黑素處理）從骨髓分離出中性粒細胞。結果表明，Cxcl2敲低的褪黑素處理Panc02細胞的上清液未能誘導腫瘤細胞凋亡和引起中性粒細胞遷移（圖5N、O）。這些觀察表明，褪黑素誘導的PAAD細胞Cxcl2表達是抗腫瘤中性粒細胞募集到腫瘤微環境的原因。

圖5 褪黑素刺激下胰腺腫瘤分泌的CXCL2可誘導中性粒細胞募集

6. 褪黑素誘導PAAD中性粒細胞的N1樣抗腫瘤表型發展

有證據表明，腫瘤微環境中的中性粒細胞可能具有不同的表型，即N1樣抗腫瘤表型或N2樣促腫瘤表型，其特征是細胞形態和細胞代謝的差異以及一系列基因的表達。為了研究褪黑素治療是否使中性粒細胞群體向N1樣表型傾斜，作者分析了PAAD小鼠腫瘤微環境中的中性粒細胞群體。作者觀察到，接受褪黑素治療的PAAD小鼠的中性粒細胞表現出較低水平的前向散射（圖6A）和較高水平的CD11b（圖6B），這提示其具有抗腫瘤特性和活化表型。考慮到N1和N2表型可能在不同水平表達相似的基因譜，作者測量了幾個可以代表特定表型的基因表達，并計算了N1/N2樣基因表達標志物的比值。來自褪黑素處理的PAAD小鼠的分選CD11bLy6G中性粒細胞顯示N1/ N2樣基因表達標志物的比率增加（圖6C），提示褪黑素治療可將PAAD腫瘤微環境中的中性粒細胞極化為N1樣表型。透射電子顯微鏡下的形態學評估顯示，褪黑素處理的PAAD的中性粒細胞中有更多的空泡化結構和脫顆粒（圖6D），HE染色顯示褪黑素處理的PAAD的中性粒細胞中有更多的細胞質嗜天青顆粒和超分葉的細胞核（圖6E、F），進一步提示N1樣表型。

為了進一步研究褪黑素處理的PAAD腫瘤中性粒細胞向N1樣抗腫瘤表型極化的細胞機制，作者從褪黑素處理和未處理的小鼠PAAD腫瘤中分選了CD11bLy6G中性粒細胞。作者使用非標記蛋白質組學分析來鑒定差異表達譜（圖6G）。突顯蛋白富集的生物學通路表明，褪黑素處理可能在PAAD腫瘤的中性粒細胞中誘導糧農組織（圖6H）。增加的FAO產生細胞ROS和NETs54。為了確定褪黑素誘導的中性粒細胞的抗腫瘤活性是否依賴于脂肪酸氧化的激活，作者用FAO抑制劑etomoxir預處理褪黑素處理的PAAD中的中性粒細胞，然后與Panc02細胞共培養。etomoxir預處理顯著減少了褪黑素誘導的中性粒細胞細胞內ROS的產生（圖6I），并消除了其誘導Panc02細胞凋亡的活性（圖6J）。這些發現表明，褪黑素誘導的細胞FAO導致了PAAD TME內中性粒細胞的N1樣表型和抗腫瘤特性。

圖6 中性粒細胞在褪黑素存在的情況下表現出抗腫瘤N1表型

7. 褪黑素相關NETosis提示PAAD患者預后較好

為了進一步研究褪黑素相關NETosis在PAAD中的臨床意義，作者采用多重熒光染色法檢測了人PAAD標本中褪黑素、CXCL2、中性粒細胞標志物MPO和NETosis標志物H3Cit的表達。與作者在實驗動物模型中觀察到的情況相似，較高的褪黑素水平與PAAD組織中CXCL2表達增多、中性粒細胞浸潤增多和NETosis激活增加相關（圖7A）。定量分析顯示褪黑素水平與CXCL2的表達顯著相關（圖7B）和中性粒細胞浸潤（圖7C）。CXCL2的表達與中性粒細胞浸潤呈正相關，進一步證明褪黑素誘導的中性粒細胞浸潤需要CXCL2（圖7D）。此外，胰腺褪黑素與MPO中性粒細胞中H3Cit的表達呈正相關，表明中性粒細胞中的NETosis激活與PAAD中的褪黑素相關（圖7E）。

對PAAD患者OS進行亞組分析，也發現褪黑素生成與NETosis相關事件相關。高水平的褪黑素只能預測CXCL2相對高表達的患者更好的生存，而不能預測CXCL2相對低表達的患者（圖7F）。類似地，只有當中性粒細胞MPO浸潤水平相對較高時，PAAD患者的褪黑素生成與較好的生存率相關（圖7G）。在CXCL2相對高表達的情況下，更多的中性粒細胞延長了患者的生存時間，中性粒細胞僅在高表達CXCL2的PAAD患者中分化生存（圖7H）。這些觀察表明CXCL2/中性粒細胞在褪黑素在PAAD中的腫瘤抑制作用中起重要作用。此外，在浸潤到腫瘤組織的中性粒細胞中H3Cit水平相對較高的PAAD患者中，發現褪黑素水平與更好的生存相關（圖7I），提示NETosis激活在介導PAAD中褪黑素的腫瘤抑制功能中潛在的重要作用。這些觀察結果表明，褪黑素相關的CXCL2/中性粒細胞NETosis可能也存在于人類中，并且可以預測PAAD患者更好的生存。

圖7 

結論：

該研究表明褪黑素在胰腺癌中通過促進TME中中性粒細胞的浸潤和NETosis發揮抗腫瘤作用。盡管其他研究報道了NETs在腫瘤發展中的負面影響，包括組織損傷、炎癥和可能的轉移，但該研究證明了中性粒細胞募集到腫瘤免疫微環境中的有益作用，以及NETs對腫瘤細胞的殺傷機制。臨床樣本中的類似關聯表明，褪黑素可能是驅動胰腺癌腫瘤抑制的免疫調節劑。

參考文獻：

Chan YT, Tan HY, Lu Y, Zhang C, Cheng CS, Wu J, et al. Pancreatic melatonin enhances anti-tumor immunity in pancreatic adenocarcinoma through regulating tumor-associated neutrophils infiltration and NETosis. Acta Pharm Sin B. 2023 Apr; 13(4):1554-1567.