實驗方法：質粒構建，細胞轉染，Western blot，免疫沉淀（IP），實時熒光定量PCR，LC-MS/MS分析，細胞增殖，克隆形成，Transwell，劃痕實驗，免疫熒光，動物實驗，免疫組化

乙?；揎椩谀[瘤的增殖和轉移中起著重要作用。磷脂酰磷組氨酸無機焦磷酸鹽磷酸酶（LHPP）在某些腫瘤中下調，具有抑制腫瘤的作用。然而，LHPP在鼻咽癌（NPC）中的表達調控及其功能尚不清楚。在本研究中，作者發現LHPP在鼻咽癌中下調，并且LHPP的過表達抑制了鼻咽癌細胞的增殖和侵襲。在機制上，HDAC4在K6處使LHPP去乙?；?，并通過TRIM21介導的k48連鎖泛素化促進LHPP的降解。證實HDAC4在鼻咽癌細胞中高表達，并通過LHPP促進鼻咽癌細胞的增殖和侵襲。進一步研究發現，LHPP可以抑制酪氨酸激酶TYK2的磷酸化，從而抑制STAT1的活性。在體內，敲除HDAC4或靶向HDAC4的小分子抑制劑Tasquinimod可通過上調LHPP顯著抑制NPC的增殖和轉移。綜上所述，作者的研究結果表明HDAC4/LHPP信號軸通過上調TYK2-STAT1磷酸化激活促進鼻咽癌的增殖和轉移。本研究將為鼻咽癌轉移提供新的證據和干預靶點。

技術路線：

主要研究結果：

1、LHPP在NPC中去乙酰化且低表達

為研究NPC中去乙酰化直接調控的抑癌蛋白，用廣譜HDACi（組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589處理NPC HK1細胞，用高效液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）分析數據（圖1A）。聚類熱圖分析表明，LBH589處理后，23個蛋白的乙?；斤@著上調（fold change > 3 , p < 0.05）（圖1B）。其中，LHPP是乙酰化水平上調最明顯的3個分子之一，也是3個分子中唯一的修飾酶。為證實LHPP在NPC細胞中受乙酰化直接調控，分別用LBH589和另一種廣譜HDACi Belinostat（PXD101）處理HK1和5-8F細胞，并用泛乙?；贵w（Acetylation-lysine）進行IP實驗。與內源性結果一致，數據顯示HDACi顯著提高LHPP的乙?；剑▓D1C）。進一步，用Flag- LHPP轉染HK1和5-8F細胞，并用HDACi處理，用Flag或乙?；嚢彼峥贵w進行IP實驗，分別檢測外源LHPP的乙?；?。與內源性結果一致，數據顯示在HDACi處理后LHPP的乙酰化水平明顯上調（圖1D-E）。為進一步分析LHPP的乙酰化水平是否影響蛋白表達，進行了western blot分析，結果顯示HDACi處理顯著增加NPC細胞中LHPP的蛋白表達（圖1F）。同時，與人正常鼻咽細胞NP69相比，LHPP在鼻咽癌細胞中的表達明顯下調（圖1G）。對臨床NPC樣本進行IHC分析發現，與癌旁組織相比，LHPP在腫瘤組織中低表達（圖1H）。綜上所述，LHPP在NPC中低表達，可能是由去乙?；揎椧鸬?。

圖1 LHPP在NPC中去乙酰化且低表達

2、過表達LHPP可抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲

為研究LHPP在鼻咽癌細胞中的生物學功能，將pcDNA3.1-LHPP質粒轉染NPC細胞HK1、5-8F和HONE1。CCK8實驗表明，與對照組相比，LHPP過表達降低了NPC細胞活力（p < 0.001）（圖2A）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，與對照組相比，LHPP過表達細胞形成的克隆數明顯降低（p < 0.01）（圖2B）。劃痕實驗證實LHPP過表達細胞的遷移能力降低（p < 0.01）（圖2C）。Transwell實驗結果顯示，過表達LHPP細胞的侵襲能力也明顯受到抑制（p < 0.01）（圖2D）。因此，LHPP抑制NPC細胞的增殖和侵襲。

圖2過表達LHPP可抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲

3、HDAC4介導LHPP去乙酰化

為鑒定介導LHPP去乙?；恼{控酶，分別用曲古抑菌素A（TSA，HDAC家族去乙酰化酶抑制劑）和煙酰胺（NAM，SIRT家族去乙?；敢种苿┨幚鞨K1和5-8F細胞。結果發現，TSA處理后LHPP蛋白增加，而NAM處理后LHPP蛋白變化不明顯（圖3A）。使用兩種選擇性去乙酰化酶抑制劑LMK-235（主要針對HDAC4/5）和MS-275（靶向HDAC1/3/2）處理NPC細胞后，結果顯示LMK-235可明顯上調LHPP蛋白表達（圖3B）。在293T細胞中轉染Flag-LHPP和His-HDAC4/5質粒，IP實驗結果顯示LHPP可以與HDAC4相互作用，但不能與HDAC5相互作用（圖3C）。HK1和5-8F細胞的內源性IP實驗也證實了LHPP與HDAC4的相互作用（圖3D）。與此結果一致，免疫熒光實驗證明LHPP和HDAC4主要共定位于NPC細胞的細胞質中（圖3E）。此外，IP實驗結果顯示過表達HDAC4可以顯著降低LHPP的乙?；剑▓D3F），western blot結果顯示下調HDAC4后LHPP表達上調，過表達HDAC4后LHPP表達下調（圖3G）。這些結果表明，在NPC細胞中，HDAC4負調控LHPP的表達。此外，在作者的前期實驗中，用LBH589處理NPC HK1細胞后，通過LC-MS/MS鑒定了LHPP的K6乙?；▓D3H）。將Flag-LHPP、K6R（模擬去乙?；┖蚄6Q（模擬乙?；┵|粒轉入293T細胞后，IP實驗結果顯示K6R突變顯著降低LHPP乙?；?，而K6Q突變不影響LHPP乙?；▓D3I）。這些結果表明HDAC4通過K6去乙酰化抑制LHPP的表達。

圖3 HDAC4調控LHPP的去乙?；?/span>

4、LHPP的去乙?；龠MTRIM21介導的k48相關泛素化降解

為探究去乙?；种芁HPP表達的機制，在HK1和5-8F細胞中敲低HDAC4后，qPCR結果顯示LHPP mRNA無明顯變化，提示HDAC4對LHPP的抑制主要通過翻譯后修飾調控。隨后，建立HDAC4敲低穩定細胞株HK1-shHDAC4和5-8F-shHDAC4。Western blot結果顯示，在蛋白合成抑制劑環己酰亞胺（CHX）處理下，HDAC4敲低能夠抑制LHPP的降解（圖4A）。進一步利用Flag LHPP質粒構建LHPP過表達穩轉細胞株5-8F-LHPP-OE。IP實驗結果顯示，敲低HDAC4后，LHPP的泛素化水平明顯降低（圖4B）。在293T細胞中轉染HA-Ub和Flag-LHPP、K6R和K6Q質粒后，結果顯示K6R導致泛素化增加，表明LHPP的泛素化依賴于其K6去乙?；▓D4C）。不同類型的泛素連接賦予泛素化不同的功能。K48連接的泛素化主要參與蛋白酶體途徑降解，K63連接的泛素化主要參與蛋白穩定性和信號轉導。為明確LHPP的泛素連接類型，內源性IP實驗結果顯示LHPP的泛素化主要是K48連接，而K63連接的泛素化沒有觀察到（圖4D）。與此一致，Flag-LHPP以及HA-Ub、HA-K48和HA-K48R質粒轉染293T細胞，IP實驗結果驗證LHPP的K48位泛素化（圖4E）。為闡明調控LHPP的E3連接酶，將Flag-LHPP質粒轉入5-8F細胞中，進行IP和質譜分析，鑒定與LHPP相互作用的蛋白。結果表明TRIM21可能是作用于LHPP的主要E3連接酶（圖4F）。IP實驗表明TRIM21確實與LHPP存在相互作用（圖4G）。免疫熒光實驗也顯示LHPP與TRIM21的共定位主要存在于NPC細胞的細胞質中（圖4H）。在293T細胞中轉染His-TRIM21、Flag-LHPP和HA-Ub質粒后，結果顯示TRIM21過表達增加LHPP泛素化（圖4I）。在轉染si TRIM21的5-8F-LHPP-OE細胞中進行IP實驗，結果顯示敲低TRIM21后，LHPP的K48位泛素化水平降低（圖4J）。這些結果表明TRIM21促進NPC細胞中LHPP的蛋白酶體依賴性降解。為確定LHPP乙酰化在TRIM21介導的泛素化中的作用，進行IP實驗表明K6R增強LHPP與TRIM21的相互作用（圖4K）。上述結果說明，LHPP的去乙?；龠MTRIM21介導的K48連接的泛素化和降解，從而降低LHPP的穩定性和表達。

圖4 LHPP的去乙酰化促進TRIM21介導的k48相關泛素化降解

5、HDAC4通過LHPP促進NPC細胞增殖和侵襲

為闡明HDAC4是否通過LHPP影響NPC細胞的增殖和侵襲，建立了HDAC4和LHPP雙敲低的穩定NPC細胞系。CCK8和克隆形成實驗結果表明，敲低HDAC4后細胞增殖能力下降，而雙敲低HDAC4和LHPP可逆轉shHDAC4處理介導的NPC細胞增殖抑制（圖5A-B）。劃痕和transwell實驗結果也顯示HDAC4敲低后細胞遷移和侵襲能力受到抑制，雙敲低HDAC4和LHPP可以挽救HDAC4敲低介導的抑制（圖5C-D）。這些結果表明HDAC4通過抑制LHPP促進NPC細胞的增殖和侵襲。

圖5 HDAC4通過LHPP促進NPC細胞增殖和侵襲

6、LHPP抑制NPC中酪氨酸激酶TYK2的磷酸化

為探究在NPC細胞中LHPP直接調控的下游激酶，在5-8F細胞中過表達LHPP后，進行IP和質譜分析。鑒定到3個激酶HK2、Tyrosine kinase 2（TYK2）和MAP4K4，未發現AKT和GSK-3β（圖6A）。結果提示LHPP可能存在其他直接靶向的激酶。在LHPP過表達的5-8F-LHPP-OE細胞中，Western blot結果顯示TYK2的磷酸化水平明顯降低，而HK2的磷酸化水平無明顯變化（圖6B）。進一步的實驗在5-8F細胞中轉染Flag-LHPP，結果顯示LHPP可以與P-TYK2相互作用（圖6C）。免疫熒光數據也證實P-TYK2和LHPP主要共定位于NPC細胞的細胞質和細胞核中（圖6D）。在HK1、HONE1和5-8F細胞中過表達LHPP后，Western blot檢測結果顯示STAT1磷酸化水平明顯降低，TYK2磷酸化激活水平下調，而STAT3磷酸化水平無明顯變化（圖6E）。35例人臨床鼻咽癌樣本的IHC分析結果顯示，LHPP與HDAC4、P-TYK2和P-STAT1呈顯著負相關，而HDAC4與P-TYK2和P-STAT1呈顯著正相關。這些結果表明，LHPP通過抑制TYK2的磷酸化激活來降低STAT1的磷酸化。

圖6 LHPP抑制鼻咽癌酪氨酸激酶TYK2的磷酸化

7、HDAC4在體內通過抑制LHPP的表達促進NPC細胞增殖和轉移

為評估LHPP在體內對NPC生長的影響，作者使用5-8F-LHPP-OE細胞建立異種移植瘤模型。結果顯示，與對照組相比，LHPP過表達顯著抑制了皮下移植瘤的生長（圖7A-C）。IHC染色分析表明LHPP的過表達抑制P-TYK2和PSTAT1的表達，增殖標志物Ki67的表達降低（圖7D）。此外，腫瘤轉移模型結果顯示，與對照組相比，5-8F-sh HDAC4組和Tasquinimod處理組均顯著減少了肺部轉移灶的數量（圖7E-F）。轉移灶中HDAC4、LHPP和P-TYK2的IHC染色顯示，sh HDAC4組HDAC4和P-TYK2表達明顯降低，LHPP水平升高（圖7G）。以上結果說明，抑制HDAC4可以增加LHPP的表達，從而抑制TYK2/STAT1信號，抑制鼻咽癌的生長和轉移。

圖7 HDAC4在體內通過抑制LHPP的表達促進鼻咽癌的增殖和轉移

圖8 LHPP在鼻咽癌細胞中的調控機制及功能模型

結論

總之，作者的工作首次揭示了在NPC中，HDAC4在K6去乙?；疞HPP，通過增強TRIM21介導的K48位泛素化促進LHPP的降解，從而失去對TYK2磷酸化激活的抑制作用，上調STAT1磷酸化，進一步促進NPC的增殖和轉移（圖8）。本研究為靶向NPC轉移提供了新的實驗證據和干預靶點。

參考文獻

Sun X, Zhang K, Peng X, Zhou P, Qu C, Yang L, Shen L. HDAC4 mediated LHPP deacetylation enhances its destabilization and promotes the proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 2023 Apr 5;562:216158. doi: 10.1016/j.canlet.2023.216158. Epub ahead of print. PMID: 37023940.