實驗方法：外泌體分離，PMEVCs分離，transwell，劃痕試驗，管形成試驗，ROS和抗氧化活性的檢測，small RNA測序，雙熒光素酶報告基因實驗，動物實驗，WB，ELISA，肺損傷測量，HE，免疫熒光，流式。

膿毒癥是一種發病率和死亡率高的致命疾病，急性肺損傷是其最早和最嚴重的并發癥。過度炎癥引起的肺微血管內皮細胞（PMVECs）損傷在膿毒癥急性肺損傷中起重要作用。本研究旨在探討脂肪來源干細胞（ADSCs）外泌體對過度炎癥性PMVECs損傷的保護作用及其機制。我們成功分離出ADSCs外泌體，并證實了其特征。ADSCs外泌體減少了PMVECs中過度炎癥反應誘導的ROS積累和細胞損傷。此外，ADSCs外泌體抑制過度炎癥反應誘導的鐵死亡，上調GPX4在PMVECs中的表達。進一步的GPX4抑制實驗表明，ADSCs外泌體通過上調GPX4來緩解炎癥反應引起的鐵死亡。同時，ADSCs外泌體可增加Nrf2的表達和核易位，降低Keap1的表達。miRNA分析和進一步的抑制實驗證實，ADSCs外泌體特異性遞送miR-125b-5p可抑制Keap1，緩解鐵死亡。在CLP誘導的膿毒癥模型中，ADSCs外泌體可減輕肺組織損傷，降低死亡率。此外，ADSCs外泌體可減輕肺組織氧化應激損傷和鐵死亡，顯著提高Nrf2和GPX4的表達。綜上所述，我們揭示了一種新的潛在治療機制，即ADSCs外泌體中的miR-125b-5p可以通過調節Keap1/Nrf2/GPX4表達，緩解膿毒癥急性肺損傷中炎癥誘導的PMVECs鐵死亡，從而改善膿毒癥急性肺損傷。

技術路線

結果

1）ADSCs和外泌體的特征

從脂肪組織分離的原代ADSCs倒置顯微鏡下呈紡錘形(圖1A)。如圖1B所示，特異性間充質干細胞表面標志物CD29、CD44、CD73和CD90在原代ADSCs中呈陽性表達。這些結果證實了ADSCs的特征。然后提取外泌體，用TEM、western blot和NTA進行鑒定。透射電鏡下分離得到的囊泡呈杯狀典型外泌體形態，具有雙層膜結構(圖1C)。Western blot結果顯示，外泌體分子標志物CD63、CD9和TSG101在分離顆粒中高表達(圖1D)。NTA結果顯示，顆粒直徑為50 ~ 150 nm，平均為117.5 nm(圖1E)。CD31免疫熒光結果顯示，從肺毛細血管分離的細胞被CD31陽性染色，說明我們成功分離了PMVECs(圖1F)。如圖1G所示，PKH26標記的外泌體可被PMVECs吸收。這些結果都表明我們成功分離了ADSCs外泌體和PMVECs。

圖1

2）ADSCs外泌體改善了炎癥反應引起的PMVECs損傷

從新生小鼠肺組織中成功分離出原發性PMVECs。將LPS誘導RAW264.7細胞的條件培養基(CM)加入PMVECs細胞誘導損傷。同時，在PMVECs中加入ADSCs外泌體以保護其免受巨噬細胞CM誘導的損傷(圖2A)。CCK8結果顯示，LPS誘導的巨噬細胞CM處理PMVECs的細胞活力減弱(圖2B)。流式細胞術結果顯示，LPS誘導的巨噬細胞CM處理PMVECs的細胞凋亡率顯著高于未處理的PMVECs(圖2C)。然而，當用ADSCs外泌體處理PMVECs時，PMVECs的活力恢復(圖2B)，凋亡率減少（圖2D）。Caspase3免疫熒光結果也驗證了巨噬細胞CM對PMVECs凋亡的上調作用和ADSCs的下調作用。如圖2D所示，用LPS誘導的巨噬細胞CM處理PMVECs時，Ki67的熒光強度降低，而使用ADSCs外泌體時，Ki67的熒光強度升高。在成管實驗中，巨噬細胞CM組的成管數量低于對照組和ADSCs外泌體組(圖2D)。transwell實驗和劃痕實驗均顯示，巨噬細胞CM削弱了PMVECs的遷移能力，而ADSCs外泌體可以恢復PMVECs的遷移能力（圖2E，2F）。因此，上述結果表明，LPS誘導的巨噬細胞CM損傷了PMVECs的活力、增殖和遷移，而ADSCs改善了巨噬細胞CM誘導的損傷，減少了細胞凋亡。

圖2

3）ADSCs外泌體減少了PMVECs中炎癥反應誘導的ROS積累

為了揭示ADSCs外泌體對巨噬細胞CM刺激的PMVECs的保護作用，我們檢測了不同處理PMVECs的ROS積累、DNA損傷和抗氧化活性。流式細胞術和免疫熒光結果顯示，當PMVECs暴露于LPS誘導的巨噬細胞CM時，ROS的積累顯著增加，而ADSCs外泌體則減緩了ROS的積累(圖3A和3B)。8-OHdG作為DNA損傷的指標，免疫熒光結果顯示LPS誘導的巨噬細胞CM可增加PMVECs中8-OHdG的表達，而ADSCs外泌體抵消了巨噬細胞CM的上調作用。在LPS誘導的巨噬細胞CM作用下，PMVECs中SOD含量和CAT活性降低(圖3D)。如圖3D所示，ADSCs外泌體可增加PMVECs中SOD含量和CAT活性。線粒體膜電位(MMP)是線粒體功能狀態的關鍵指標，也是細胞凋亡的指標之一，可以通過膜電位敏感染料JC-1進行檢測。如圖3E所示，在對照組和ADSCs外泌體組中，大部分線粒體呈紅色熒光，而LPS誘導的巨噬細胞CM中熒光以綠色為主。即對照組和ADSCs外泌體組MMP均高于CM組。總之，暴露于LPS誘導的巨噬細胞CM導致PMVECs中ROS積累和氧化損傷，但ADSCs外泌體減少了PMVECs中炎癥反應誘導的ROS積累和損傷。

圖3

4）ADSCs外泌體減少PMVECs炎癥反應誘導的鐵死亡

為驗證ADSCs外泌體對PMVECs炎癥反應誘導損傷的調節作用機制，進一步檢測鐵死亡相關指標。通過4-羥基壬烯醛(4HNE)修飾和丙二醛(MDA)檢測脂質過氧化水平。如圖4A和4B所示，LPS誘導的巨噬細胞CM顯著增加了PMVECs的脂質過氧化表達，而ADSCs外泌體則降低了其表達。此外，LPS誘導巨噬細胞CM下調了GSH和FRAP的表達，增加了MDA的表達。但ADSCs外泌體可緩解CM誘導的GSH、FRAP下調和MDA升高(圖4C)。進一步的免疫熒光結果顯示，LPS誘導的巨噬細胞CM增強了4HNE的熒光強度，削弱了GPX4的熒光強度(圖4D)。ADSCs外泌體可以逆轉LPS誘導的巨噬細胞CM引發的變化(圖4D)。western blot結果證實LPS誘導的巨噬細胞CM和ADSCs外泌體對4HNE和GPX4表達具有相同的調節作用(圖4E)。western blot結果顯示，CM處理的PMVECs 中HO-1和Nrf2表達略有升高，而ADCSs外泌體組HO-1和Nrf2表達顯著升高(圖4E)。綜上所述，LPS誘導的巨噬細胞CM可增加PMVECs 中ROS積累和鐵死亡水平，而ADSCs外泌體可使其恢復。

圖4

5）ADSCs外泌體通過上調GPX4緩解PMVECs炎癥反應誘導的鐵死亡

上述結果表明，ADSCs外泌體可以抑制鐵死亡，并增加GPX4。通過GPX4抑制實驗進一步驗證ADSCs外泌體是否通過調節GPX4對PMVECs的鐵死亡有抑制作用。如圖5A所示，當RSL3抑制GPX4的表達時，即使用ADSCs外泌體處理PMVECs，細胞活力和FRAP含量也會急劇下降。相反，當RSL3抑制GPX4的表達時，脂質過氧化水平及其產物顯著升高。western blot結果顯示，RSL3處理PMVECs后，4HNE和HO-1表達顯著增加，GPX4表達明顯抑制。當GPX4表達被RSL3抑制時，ADSCs外泌體對炎癥反應誘導的鐵死亡的保護作用被取消(圖5B)。也就是說，ADSCs外泌體通過上調GPX4在PMVECs中緩解炎癥反應誘導的鐵死亡。

圖5

6）ADSCs外泌體調節PMVECs中Nrf2通路的表達

Nrf2和Keap1信號通路是通過調控下游基因HO-1、GXP4、NQO1等降低氧化應激的最關鍵、最經典的細胞防御和生存通路之一。因此，我們檢測了Nrf2通路中重要成分的表達。如圖4E所示，western blot結果顯示，暴露于LPS誘導的巨噬細胞CM時Nrf2表達略有升高，而ADSCs外泌體處理時Nrf2表達顯著升高。此外，ADSCs外泌體可以增加下游抗氧化基因HO-1和GXP4的表達(圖4E)。western blot和PCR結果也顯示ADSCs外泌體可上調Nrf2的表達，下調Nrf2的負調控因子Keap1的表達(圖6A和6B)。western blot檢測細胞質和細胞核中的Nrf2蛋白，結果顯示ADSCs外泌體可輕微增加細胞質Nrf2的表達，而顯著增加細胞核Nrf2的表達(圖6C)。綜上所述，ADSCs外泌體可通過調節Keap1/Nrf2/GPX4軸緩解LPS誘導的巨噬細胞CM誘導的ROS積累、氧化損傷和鐵死亡。

圖6

7）ADSCs外泌體通過miR-125b-5p的傳遞調控PMVECs中的Nrf2通路

為了繪制ADSCs外泌體的miRNA表達譜，進行了微陣列分析。如圖7A所示，多達63個miRNAs在ADSCs外泌體中被檢測到。最豐富的前15個miRNAs為miR-24-3p、miR-23a-3p、miR-12136、miR-19b- 3p、let-7b-5p、let-7a-5p、let-7i-5p、miR-126-5p、miR-145-5p、miR-214- 3p、miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-3662和miR-423-5p。為了預測檢測到的miRNA的潛在靶基因，我們探索了miRDB、miRtarbase、starBase和TargetScan數據庫，并進一步研究了預測靶基因。值得注意的是，Keap1是miR-125b-5p的預測潛在靶點。然后，qRT-PCR結果證實miR-125b-5p在ADSCs外泌體中表達(圖7B)，并且在ADSCs外泌體處理PMVECs后，miR-125b-5p的表達大幅增加(圖7C)。隨后，通過雙熒光素酶報告基因分析驗證miR-125b-5p對Keap1的調控作用。如圖7D所示，miR-125b-5p的過表達降低了Keap1-3'UTR-wt報告基因的活性。即Keap1是miR-125b-5p的調控靶點，miR-125b-5p可以與Keap1基因的3'UTR結合。為了進一步驗證miR-125b-5p對Keap1的調控作用，我們設計合成了miR-125b-5p的模擬物和抑制劑，并將其轉染到PMVECs中。如圖7E所示，mimic顯著促進miR-125b-5p的表達，而inhibitor則保持不變。mimic上調miR-125b-5p表達后，Keap1表達被抑制，Nrf2和GPX4表達上調。同樣，抑制劑增加了Keap1的表達，而降低了Nrf2和GPX4的表達(圖7F)。此外，我們用抑制劑轉染ADSCs外泌體，將其加入PMVECs中，并與ADSCs外泌體比較其對Keap1通路的調控作用。結果表明，當miR-125b-5p在ADSCs外泌體中被抑制劑抑制表達時(圖7G)， Keap1的下調和Nrf2、GPX4的上調均得到緩解(圖7H)。即當miR-125b-5p在ADSCs外泌體中被抑制表達時，ADSCs外泌體對Keap1/Nrf2/GPX4軸的調控作用被抵消。總之，ADSCs外泌體對Keap1/Nrf2/GPX4軸的調節作用取決于miR-125b-5p的傳遞。

圖7 

8）ADSCs外泌體緩解CLP誘導的小鼠急性肺損傷

為了檢測ADSCs外泌體對膿毒癥急性肺損傷的保護作用，如圖8A所示，我們建立了CLP膿毒癥模型，并用ADSCs外泌體進行治療。結果顯示，CLP組小鼠24小時死亡一半，48小時死亡80%(圖8B)。當使用ADSCs外泌體治療時，24小時死亡率下降到10%，48小時死亡率下降到60%(圖8B)。收集肺組織進行HE染色，并通過肺損傷評分、支氣管肺泡灌洗液(BALF)和濕/干比分析進行損傷評分。CLP組小鼠BALF中蛋白濃度及干濕比均顯著高于假手術組及ADSCs外泌體組(圖8C)。HE結果顯示，與假手術組相比，CLP組肺泡毛細血管腫脹充血，肺泡腔出血，并伴有炎癥細胞浸潤(圖D)。而ADSCs外泌體明顯改善上述損傷。此外，CLP增加了小鼠肺損傷評分，而ADSCs外泌體降低了肺損傷評分(圖8E)。因此，ADSCs外泌體緩解了CLP誘導的小鼠急性肺損傷。

圖8

9）ADSCs外泌體緩解CLP誘導的ROS并增強小鼠的抗氧化能力
為了檢測CLP誘導的炎癥反應和ADSCs外泌體對肺血管內皮細胞氧化應激和損傷的影響，檢測了ROS、SOD、FRAP、MDA和GSH。如圖9A所示，結果顯示CLP處理后ROS水平明顯升高，而ADSCs外泌體可以減少ROS的積累。MDA檢測顯示，膿毒癥小鼠BALF中MDA水平遠高于假手術組和ADSCs外泌體組(圖9A)。同時，CLP處理后抗氧化劑SOD、FRAP和GSH水平顯著降低，ADSCs外泌體可恢復其含量。Tunel染色顯示CLP增加小鼠肺組織凋亡，而ADSCs外泌體減輕膿毒癥大鼠肺組織凋亡(圖9B)。OHdG和CD31免疫熒光雙染色顯示CLP組CD31陽性細胞8OHdG表達明顯升高，而ADSCs外泌體組較CLP組表達降低(圖9C)。

圖9

10）ADSCs外泌體通過上調肺組織GPX4緩解CLP誘導的鐵死亡

為驗證ADSCs外泌體對CLP誘導的急性肺損傷中鐵死亡和GPX4表達的調節作用，采用western blot、PCR和免疫熒光染色檢測4HNE和GPX4的表達。如圖10A所示，western blot結果顯示CLP處理后肺組織中4HNE蛋白表達顯著增加，而ADSCs外泌體處理后4HNE蛋白表達顯著降低。相反，加入CLP后GPX4表達下調，加入ADSCs外泌體后GPX4表達上調。有趣的是，CLP和ADSCs外泌體均能增加HO-1的表達，而ADSCs外泌體比CLP更能增加HO-1的表達(圖10A)。4HNE、GPX4和HO-1的免疫組化染色結果也顯示CLP處理增加了肺組織中4HNE和HO-1陽性細胞，減少了GPX4陽性細胞(圖10B)。ADSCs外泌體減少了4HNE陽性細胞數量，增加了GPX4和HO-1陽性細胞數量(圖10B)。PCR結果與western blot和免疫組化結果一致(圖10C)。此外，4HNE和GPX4免疫熒光染色結果也顯示CLP在肺組織中增加了4HNE表達，減少了GPX4表達，而ADSCs外泌體增加GPX4表達，降低4HNE表達(圖10D)。因此，ADSCs外泌體通過上調肺組織中的GPX4來緩解CLP誘導的鐵死亡。

圖10 

11）ADSCs外泌體在CLP誘導的急性肺損傷中調控Keap1/Nrf2的表達

Keap1/Nrf2系統通過調控GPX4、HO-1等一系列抗氧化基因，是氧化應激系統的關鍵元件。如圖11A所示，在CLP誘導的膿毒癥肺組織中Nrf2蛋白表達略有升高，在ADSCs外泌體處理的小鼠中Nrf2蛋白表達明顯升高。然而，Keap1在CLP誘導的膿毒癥肺組織中表達略有降低，在ADSCs外泌體處理的小鼠中表達顯著降低(圖11A)。PCR結果也顯示ADSCs外泌體處理的膿毒癥小鼠肺組織中Nrf2 mRNA表達升高(圖11A)。Nrf2和CD31免疫熒光雙染色結果顯示Nrf2在CD31+細胞中的平均熒光強度高于CD31?細胞，在ADSCs外泌體小鼠肺組織中的熒光強度高于CLP組(圖11B)。此外，Nrf2免疫組化染色結果也表明，該抗氧化分子在CLP小鼠肺組織中略有上調，而在ADSCs外泌體作用下則顯著上調(圖11B)，因此，ADSCs外泌體調節了CLP誘導的急性肺損傷中Keap1/Nrf2的表達。

圖11

結論：我們揭示了一種新的潛在治療機制，即ADSCs外泌體傳遞miR-125b-5p可通過調節Keap1/Nrf2/GPX4表達，緩解膿毒癥急性肺損傷所致的PMVECs鐵死亡，從而改善膿毒癥急性肺損傷。

參考文獻：Shen K, Wang X, Wang Y, Jia Y, Zhang Y, Wang K, Luo L, Cai W, Li J, Li S, Du Y, Zhang L, Zhang H, Chen Y, Xu C, Zhang J, Wang R, Yang X, Wang Y, Hu D. miR-125b-5p in adipose derived stem cells exosome alleviates pulmonary microvascular endothelial cells ferroptosis via Keap1/Nrf2/GPX4 in sepsis lung injury. Redox Biol. 2023 Mar 9;62:102655. doi: 10.1016/j.redox.2023.102655.