可變剪接（AS）在細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中受到嚴(yán)密調(diào)節(jié)。AS事件在睪丸中普遍存在，但剪接在精子發(fā)生中的調(diào)控仍不清楚。本文發(fā)現(xiàn)剪接體成分Bud31介導(dǎo)的AS事件在小鼠精子發(fā)生過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。Bud31介導(dǎo)的AS是精原干細(xì)胞（SSC）調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雄性生殖細(xì)胞的自我更新和分化所必須的。本實(shí)驗(yàn)采用構(gòu)建生殖細(xì)胞特異性Bud31敲除小鼠，細(xì)胞培養(yǎng)，生精細(xì)胞的富集，RT-qPCR，免疫印跡，免疫組化，免疫熒光，HE染色，染色體彌散免疫熒光分析，SMART-seq，可變剪接和剪接效率分析，RIP-Seq，RNA pull-down，熒光素酶檢測(cè)，微基因分析的實(shí)驗(yàn)方法。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、生殖細(xì)胞特異性Bud31基因敲除導(dǎo)致雄性完全不育

剪接因子的表達(dá)水平在細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中受到嚴(yán)格調(diào)控。為描述參與精子發(fā)生的剪接因子，作者使用公開RNA-seq數(shù)據(jù)集（E-MTAB-6798）進(jìn)行分析，在小鼠精子發(fā)生的不同階段的睪丸中鑒定到134個(gè)已知剪接因子。其中10個(gè)剪接因子在出生后才開始表達(dá)，這是精原細(xì)胞增殖開始的時(shí)候（圖1A）。同時(shí)，使用E-MTAB-6798分析AS事件，發(fā)現(xiàn)AS事件在P3時(shí)顯著增加，與P0相比，在P28時(shí)達(dá)到峰值（圖1B）。剪接體組分Bud31是剪接體組裝和催化活性所必需的，它的表達(dá)模式與其他剪接事件在時(shí)間上協(xié)調(diào)，所以選擇它進(jìn)行深入研究。此外，Bud31和未分化精原細(xì)胞的標(biāo)記物Dazl的免疫熒光共染色顯示，在P4時(shí)，Bud31存在于生精小管Dazl陽(yáng)性細(xì)胞中，且主要定位于細(xì)胞核（圖1C）。

為闡明Bud31在精子發(fā)生中的潛在作用，將VASA-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Bud31-floxed小鼠雜交，構(gòu)建生殖細(xì)胞特異性Bud31敲除小鼠（Bud31- vKO）。對(duì)輸精管生殖細(xì)胞標(biāo)記物DAZL和Bud31進(jìn)行免疫染色，證實(shí)Bud31- vKO小鼠生殖細(xì)胞P4時(shí)Bud31缺失（圖1D）。此外，與同窩對(duì)照小鼠相比，Bud31-vKO小鼠的睪丸要小得多（圖1E）。與這種表型一致，蘇木精染色顯示Bud31-vKO小鼠睪丸中的生殖細(xì)胞數(shù)量與同窩對(duì)照組相比顯著減少（圖1F）。支持細(xì)胞標(biāo)記物Sox9和生殖細(xì)胞標(biāo)記物Gcna的免疫熒光共染顯示，在Bud31-vKO的睪丸中完全沒有Gcna陽(yáng)性細(xì)胞，但對(duì)照小鼠在P10時(shí)睪丸中存在Gcna（圖1G）。這些結(jié)果表明Bud31是精子發(fā)生所必須的。

圖1生殖細(xì)胞特異性Bud31基因敲除導(dǎo)致雄性完全不育

2、Bud31敲除導(dǎo)致SSC自我更新嚴(yán)重缺陷

為探究Bud31-vKO小鼠生殖細(xì)胞丟失的原因，進(jìn)行SSC標(biāo)志物Plzf的免疫組化，發(fā)現(xiàn)其在正常小鼠表達(dá)在Bud31-vKO小鼠丟失。為了研究Bud31-vKO小鼠SSC缺失的發(fā)生時(shí)間，在Bud31- vko和對(duì)照小鼠的P1、P2、P3、P4和P5的輸精管中分別對(duì)Bud31和Plzf進(jìn)行免疫染色。與對(duì)照組比較，Plzf陽(yáng)性細(xì)胞顯著丟失的第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)是P4（圖2A-B）。此外，對(duì)Bud31-vKO小鼠P5時(shí)期的生精小管進(jìn)行SSC另一個(gè)標(biāo)志物L(fēng)in28a免疫染色，結(jié)果顯示共表達(dá)Lin28a和Plzf的細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組（圖2C）。用qPCR檢測(cè)P4睪丸中SSC標(biāo)記（Plzf、Lin28a、Gfrα1和Id4）的表達(dá)，與對(duì)照組相比，Bud31-vKO睪丸中這些標(biāo)記的表達(dá)水平顯著降低（圖2D）。流式細(xì)胞儀分析顯示，與對(duì)照組相比，Bud31-vKO睪丸P4時(shí)表達(dá)SSC表面標(biāo)記物Thy1而不表達(dá)c-Kit的細(xì)胞數(shù)量從3.4%下降到2.26%（圖2E）。證實(shí)SSC的數(shù)量早在P4時(shí)就減少了。對(duì)來(lái)自P4時(shí)期的Bud31-vKO和對(duì)照小鼠的Thy1+/c-Kit^–分選的SSCs進(jìn)行SMART-seq分析，對(duì)差異表達(dá)基因的GO和GSEA分析顯示，PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路明顯富集，這是正常SSC自我更新的重要通路（圖2F-G）。免疫印跡驗(yàn)證了P4時(shí)期Bud31-vKO小鼠的Thy1+/c-Kit^–SSCs中mTOR信號(hào)成分的水平降低（圖2H）。這些結(jié)果提示Bud31參與新生小鼠SSC自我更新的調(diào)節(jié)。

圖2Bud31敲除導(dǎo)致SSC自我更新嚴(yán)重缺陷

3、Bud31缺失雄性小鼠生殖細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入減數(shù)分裂

為評(píng)估Bud31在雄性減數(shù)分裂中的潛在作用，將Stra8-GFPCre小鼠與Bud31^flox/flox小鼠雜交獲得生殖細(xì)胞特異性Bud31敲除雄性小鼠（Bud31- sKO）。木素染色顯示Bud31-sKO小鼠的減數(shù)分裂細(xì)胞在P10和P12時(shí)期與同窩對(duì)照組相比大幅減少（圖3A）。對(duì)P12小鼠輸精管減數(shù)分裂標(biāo)志物SYCP3和γH2AX進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)Bud31-sKO睪丸的SYCP3和γH2AX雙陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組相比顯著減少（圖3B）。重要的是，在Bud31-sKO的P12睪丸中沒有觀察到晚于具有瘦素前期樣染色體的精母細(xì)胞，而此時(shí)在對(duì)照睪丸中已經(jīng)很明顯地發(fā)現(xiàn)了豐富的合子染色體（圖3C）。這表明Bud31是生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂所必需的。

Stra8的表達(dá)是生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂所必需的，在P10小鼠的生精小管中對(duì)Stra8進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Bud31-sKO睪丸中的Stra8信號(hào)明顯減弱（圖3D）。qPCR檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，P10期Bud31-sKO小鼠中Stra8及其已知下游轉(zhuǎn)錄激活靶點(diǎn)Hoxa1和Cyp26a1的水平顯著下降（圖3E）。qPCR和免疫印跡評(píng)估Stra8，與對(duì)照組相比，P4期Bud31-vKO睪丸的Stra8水平顯著降低（圖3F-G）。這些結(jié)果再次支持Bud31具有調(diào)節(jié)減數(shù)分裂起始的功能。

圖3缺乏bud31的雄性生殖細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入減數(shù)分裂

4、Bud31在生精細(xì)胞中調(diào)控AS

為探索Bud31在精子發(fā)生中對(duì)AS的作用，使用rMATS對(duì)SMART-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行AS分析。Bud31缺失導(dǎo)致了總共1948個(gè)AS事件（圖4A-B）。隨后分析reads的映射分布，發(fā)現(xiàn)Bud31缺失顯著降低了外顯子reads的比例，增加了內(nèi)含子和基因間reads的比例（圖4C）。此外，利用SMART-seq數(shù)據(jù)計(jì)算剪接效率，發(fā)現(xiàn)敲除Bud31后，5 '剪接位點(diǎn)和3 '剪接位點(diǎn)的效率均顯著降低（圖4D），表明Bud31缺失后AS受損。

為確定Bud31在精子發(fā)生中的全基因組結(jié)合位點(diǎn)和靶點(diǎn)，利用P14野生型小鼠的生精細(xì)胞進(jìn)行RIP-seq，RIP峰值分布分析顯示，Bud31主要定位于pre- mRNA的內(nèi)含子區(qū)域（圖4E）。進(jìn)一步分析了reads強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)Bud31在剪接位點(diǎn)周圍的exon-intron區(qū)域高度富集（圖4F）。此外，使用HOMER算法來(lái)識(shí)別Bud31識(shí)別的RNAmotif，發(fā)現(xiàn)最豐富的元件是UUUAAAA和GAGGCAGG（圖4G），這對(duì)識(shí)別潛在的結(jié)合位點(diǎn)很有用。

為在生精細(xì)胞中識(shí)別Bud31調(diào)控的AS候選靶點(diǎn)，將來(lái)自RIP-seq數(shù)據(jù)中的Bud31結(jié)合基因（3258個(gè)基因）與來(lái)自SMART-seq數(shù)據(jù)集的AS相關(guān)基因（1591個(gè)基因）進(jìn)行了比較，并鑒定出392個(gè)交集基因（圖4H）。對(duì)392個(gè)基因進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)包括減數(shù)分裂細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂在內(nèi)的通路高度富集（圖4I）。以上結(jié)果表明Bud31在生精細(xì)胞中調(diào)控AS。

圖4 Bud31在生精細(xì)胞中調(diào)控AS

5、Bud31缺失導(dǎo)致Cdk2第一個(gè)內(nèi)含子的保留增加

為確定導(dǎo)致Bud31cKO小鼠表型的靶點(diǎn)，在Bud31缺失時(shí)檢測(cè)了392個(gè)基因和701個(gè)下調(diào)基因（圖4J）。發(fā)現(xiàn)12個(gè)基因，包括Cdk2，Ccdc62和Lbr都是差異剪接和下調(diào)的（圖4K）。作者關(guān)注Cdk2，它對(duì)小鼠的生存能力并不重要，但其缺失已被證明會(huì)導(dǎo)致男性不育[29]。SMART-seq分析顯示，Bud31的中斷導(dǎo)致Cdk2前mRNA的第一個(gè)內(nèi)含子的保留（圖5A，上），RIP-seq數(shù)據(jù)支持Bud31結(jié)合Cdk2的內(nèi)含子1（圖5A，下）。用半定量RT-PCR方法驗(yàn)證Bud31對(duì)Cdk2的影響，該方法在P10Bud31-sKO和同源對(duì)照小鼠的睪丸中使用了同源引物（圖5B）。為獲得進(jìn)一步的證據(jù)，構(gòu)建了跨越內(nèi)含子1的小基因，并通過(guò)將小基因與Bud31siRNA結(jié)合轉(zhuǎn)染GC-1細(xì)胞來(lái)進(jìn)行剪接試驗(yàn)。Bud31的耗竭顯著增加了Cdk2的內(nèi)含子保留的轉(zhuǎn)錄物（圖5C）。用qPCR分析了P10睪丸中長(zhǎng)短異構(gòu)體的比例，觀察到Bud31缺失后Cdk2的長(zhǎng)短異構(gòu)體比例明顯增加（圖5D）。此外，為證實(shí)Bud31對(duì)Cdk2的影響，進(jìn)行剪接報(bào)告試驗(yàn)。使用siRNAs對(duì)Bud31進(jìn)行敲除，顯著降低了由含Cdk2內(nèi)含子1的報(bào)告片段編碼的熒光素酶活性（圖5E）。為獲得Bud31與Cdk2直接結(jié)合的進(jìn)一步證據(jù)，使用Bud31抗體在P14小鼠睪丸中進(jìn)行RIP試驗(yàn)，如預(yù)期地，RIP-qPCR顯示Bud31與Cdk2pre-mRNA的內(nèi)含子1結(jié)合（圖5F）。此外，RNA pull-down實(shí)驗(yàn)顯示Bud31被生物素標(biāo)記的Cdk2探針成功下拉（圖5G）。

內(nèi)含子保留可以在轉(zhuǎn)錄后水平上減少基因表達(dá)。因此，在P10小鼠睪丸中進(jìn)行qPCR，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Bud31-sKO小鼠睪丸中的Cdk2表達(dá)明顯下調(diào)（圖5H）。還發(fā)現(xiàn)，在GC-1細(xì)胞中，由siRNA介導(dǎo)的對(duì)Bud31的敲除導(dǎo)致Cdk2水平明顯降低（圖5I）。免疫印跡法進(jìn)一步證明，與對(duì)照組相比，Bud31-vKO小鼠睪丸中這兩種蛋白的異構(gòu)體都明顯減少（圖5J）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Bud31的缺失導(dǎo)致內(nèi)含子1的保留，從而導(dǎo)致Cdk2的表達(dá)減少。總之，這些數(shù)據(jù)表明，Bud31介導(dǎo)的替代剪接參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)。

圖5Bud31缺失導(dǎo)致Cdk2第一個(gè)內(nèi)含子的保留增加

參考文獻(xiàn)：

Qin, J., Huang, T., Wang, Z. et al. Bud31-mediated alternative splicing is required for spermatogonial stem cell self-renewal and differentiation. Cell Death Differ 30, 184–194 (2023). https://doi.org/10.1038/s41418-022-01057-1