實驗方法：組蛋白提取，qChIP，海馬細胞外通量測定，莫里斯水迷宮，經腦室(ICV)注射，硫黃素S (TS)染色，免疫熒光

  小膠質細胞的促炎激活是阿爾茨海默病(AD)的一個標志，這一過程涉及從氧化磷酸化(OXPHOS)向糖酵解的轉變。我們展示了小膠質細胞中的正反饋循環如何驅動AD的發病機制，并且我們證明抑制小膠質細胞中的這一循環可以改善AD小鼠模型(5XFAD)中的Aβ負擔和認知缺陷。首先在5XFAD小鼠和AD患者的腦樣本中檢測到組蛋白乳酸化升高后，我們觀察到H4K12la水平在Aβ斑塊附近的小膠質細胞中升高。這種乳酸依賴性組蛋白修飾在糖酵解基因的啟動子上富集并激活轉錄，從而增加糖酵解活性。最終，糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路加重了AD的小膠質細胞功能障礙。藥理抑制PKM2可減弱小膠質細胞的激活，而小膠質細胞特異性消融PKM2可改善AD小鼠的空間學習和記憶。因此，破壞正反饋回路可能是治療AD的一種潛在的治療方法。本文于2022年4月發表于Cell Metabolism (IF=31.373)。

技術路線：

結果：

(1) 遺傳性AD模型小鼠海馬乳酸水平升高

已知小膠質細胞具有代謝靈活性。鑒于AD小膠質細胞中從OXPHOS到糖酵解的代謝重編程，我們首先檢測了5XFAD小鼠海馬中的乳酸水平。5XFAD是一種成熟的AD轉基因模型。比色分析顯示，與年齡匹配的WT小鼠相比，12月齡5XFAD小鼠的乳酸水平顯著升高(圖1A)，這與先前報道的結果一致，即AD患者的腦脊液(CSF)乳酸濃度高于健康對照組。

圖1：5XFAD小鼠和AD患者組蛋白乳酸活性升高

(2) 5XFAD小鼠和AD患者組蛋白乳酸化升高

由于乳酸作為一種前體可以刺激組蛋白乳酸化，因此很容易假設組蛋白乳酸化可能在AD的背景下發生改變。酸提取組蛋白的WB分析顯示，與年齡匹配的WT小鼠相比，12月齡5XFAD小鼠的額葉皮層和海馬中的泛賴氨酸乳酸化(Pan Kla)和H4K12la水平均有所增加(圖1B)。通過對小鼠的觀察，AD患者死后腦組織中Pan Kla和H4K12la的水平較健康人明顯升高(圖1C)。這些結果支持在AD的情況下乳酸和組蛋白乳酸化都增加。

(3) H4K12la水平在5XFAD小鼠斑塊鄰近小膠質細胞中特異性升高

為了檢測不同腦細胞類型中組蛋白乳酸化的變化，我們將H4K12la與針對神經元(NeuN)、星形膠質細胞(GFAP)和小膠質細胞(Iba1)標記物的抗體進行了免疫熒光共染色。大多數細胞顯示H4K12la熒光(圖1D-1F)；在5XFAD和WT小鼠之間，我們沒有觀察到神經元或星形膠質細胞中H4K12la強度的明顯差異(圖1D和圖1E)。對離體神經元和離體星形膠質細胞中酸提取的組蛋白進行WB檢測顯示，5XFAD小鼠和WT小鼠的H4K12la水平沒有差異(圖1D和1E)。然而，與遠離斑塊的5XFAD小膠質細胞和WT小膠質細胞相比，Aβ斑塊鄰近小膠質細胞的H4K12la信號強度顯著升高(圖1F)。我們從12個月大的5XFAD和WT小鼠的成年大腦中分離小膠質細胞，然后用組蛋白酸提取和抗多種形式組蛋白乳酸化的抗體進行WB分析，結果表明H4K12la是5XFAD小鼠斑塊鄰近小膠質細胞中最普遍的差異影響組蛋白乳酸化修飾(圖1G)。

(4) 小膠質細胞中H4K12la轉錄結果的全基因組分析

組蛋白修飾改變可以影響靶基因的轉錄激活和抑制。為了探索H4K12la在AD小膠質細胞中的潛在功能意義，我們進行了全基因組CUT&Tag分析，以確定小膠質細胞中受H4K12la調控的候選基因。通過磁分離收集12月齡WT或5XFAD小鼠的總腦細胞或小膠質細胞(圖2A)：使用抗H4K12la抗體的CUT&Tag和deepTools分析顯示，與WT相比，5XFAD大腦的小膠質細胞中H4K12la峰明顯富集(圖2B)。小膠質細胞對比顯示14437個不同的H4K12la結合峰，其中41.33%的峰位于啟動子序列(%3Kb)內。在所有細胞樣本中，5XFAD小鼠中只有670個差異H4K12la結合峰，其中26.12%位于啟動子序列(圖2C)。

為了研究H4K12la對5XFAD小鼠小膠質細胞的表觀遺傳調控作用，我們將5XFAD小鼠小膠質細胞啟動子處不同H4K12la結合峰的4410個靶基因按基因本體劃分為不同的KEGG通路(圖2D)。這些KEGG通路包括參與糖酵解和炎癥的HIF-1、toll樣受體、NF-kB和tnf信號通路(圖2D)。這些峰在糖酵解基因(包括Hif-1a、Pkm和Ldha)上鑒定出候選基因組位點，表明這些基因啟動子處的H4K12la水平升高(圖2E)。

定量染色質免疫沉淀(qChIP)分析表明，與WT小膠質細胞相比，5XFAD小鼠分離的小膠質細胞中Hif-1a、Pkm和Ldha啟動子上的H4K12la水平顯著升高(圖2F)。與此一致，qPCR顯示，這些基因在5XFAD小鼠的小膠質細胞中的表達水平顯著升高(圖2G)。鑒于我們發現AD小鼠的小膠質細胞中H3K18la水平升高，我們使用qChIP(使用針對H3K18la的抗體)檢測了WT和5XFAD小鼠分離的小膠質細胞。總之，H4K12la修飾激活了AD小膠質細胞中編碼已知糖酵解酶的多個基因的轉錄。

我們在2、6和12個月大的5XFAD和WT小鼠分離的小膠質細胞的時間過程數據集中檢測了組蛋白乳酸化水平。H4K12la水平在5XFAD小膠質細胞中以年齡依賴的方式增加。與年齡匹配的WT小膠質細胞相比，6月齡和12月齡的5XFAD小膠質細胞中Pan Kla和H4K12la的水平均明顯升高(圖S2A)。隨著5XFAD小鼠小膠質細胞中AD發病機制的進展，Hif-1a、Pkm2和Ldha的表達也隨之顯著增加(圖S2B)。考慮到組蛋白乳酸化依賴于糖酵解產生的底物的存在，并且考慮到我們發現H4K12la修飾促進糖酵解基因的表達，似乎有可能在H4K12la和糖酵解之間存在正反饋回路，傳播我們在AD大腦小膠質細胞中觀察到的代謝開關/重新連接(圖2H)。

圖2：小膠質細胞中H4K12la轉錄結果的全基因組分析

(5) 糖酵解/H4K12la/PKM2在AD小鼠小膠質細胞中形成正反饋回路

我們使用WB檢測分離成人小膠質細胞中的PKM2水平，發現與年齡匹配的WT小鼠相比，6個月大的5XFAD小鼠中PKM2的小膠質細胞積累顯著增加(圖3A)。與PKM2的代謝功能一致，我們還發現AD小膠質細胞中的乳酸水平顯著升高(圖3B)，支持AD小膠質細胞中有氧糖酵解的異常激活。

我們對小膠質細胞(抗iba1)和Aβ斑塊區域(抗6e10)進行了PKM2免疫熒光染色。與我們的WB結果一致，該染色顯示，與WT小鼠相比，AD小鼠腦切片中PKM2信號明顯增加(圖3C)。值得注意的是，PKM2的上調特異性地定位于Aβ斑塊鄰近的小膠質細胞，這與我們之前在AD小膠質細胞中檢測到的H4K12la水平升高一致。PKM2與神經元標記物(抗neun)或星形膠質細胞標記物(抗gfap)共染色表明PKM2未與神經元共定位(圖3D)，但在5XFAD和WT腦的星形膠質細胞中均顯示明顯的PKM2信號(圖3E)；星形膠質細胞中糖酵解的基礎水平較高，這一發現與之前的報道一致，即星形膠質細胞可以向附近的神經元供應乳酸。這些結果支持了AD小膠質細胞中存在一個由活性糖酵解、H4K12la和PKM2組成的正反饋循環的概念。

我們對死后人AD腦切片的PKM2和小膠質細胞標記物(抗iba1)和Aβ斑塊(硫黃素S, TS)進行了免疫熒光染色。與我們在5XFAD小鼠中觀察到的結果一致，與斑塊遠端和健康個體的小膠質細胞相比，PKM2在斑塊鄰近小膠質細胞中特異性上調(圖3F)。總之，這些都支持糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路可以“鎖定”AD小膠質細胞的代謝重連接。

圖3：糖酵解/H4K12la/PKM2在小膠質細胞中形成正反饋回路

(6) 抑制PKM2破壞小膠質細胞中的糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路

為了實驗證實糖酵解/H4K12la/PKM2環對小膠質細胞的功能影響，我們在培養的小膠質BV2細胞中構建了PKM2穩定敲除細胞系。Pkm2的敲低導致細胞內乳酸水平以及Pan Kla和H4K12la水平的顯著降低(圖3G和3H)。重要的是，qChIP分析顯示，與對照細胞相比，Pkm2敲低的BV2細胞中糖酵解基因啟動子(包括hif-1a、Pkm和Ldha)上的H4K12la水平顯著降低(圖3I)。與之前h4k12la介導的轉錄激活一致，qPCR顯示，在Pkm2敲低的BV2細胞中，hif-1a、Pkm2和Ldha的表達水平顯著降低(圖3J)。

用已知的PKM2抑制劑(紫草素或化合物3K)治療BV2細胞導致細胞內乳酸水平以及Pan Kla和H4K12la水平顯著降低(圖3K和3L)。與Pkm2敲低細胞的結果一致，紫草素或復方3K處理顯著降低了hif-1a、Pkm和Ldha啟動子上的H4K12la水平(圖3M)，這些基因的表達也顯著降低(圖3N)。總之， PKM2抑制破壞了小膠質細胞中的糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路。

(7) 阻斷PKM2阻斷糖酵解/H4K12la/PKM2環可抑制5XFAD小鼠的小膠質細胞活化

我們通過將Pkm2^f/f小鼠與CX₃CR₁^CreER小鼠雜交(在5XFAD背景下)，實現了小鼠小膠質細胞中Pkm2的特異性缺失(圖4A)。為了消融小膠質細胞中的Pkm2，2月齡小鼠連續5天灌胃他莫昔芬20 mg。隨后對5個月大的動物進行行為測試和病理分析(圖4A)。PKM2水平在cKO、AD (Pkm2^f/f；CX₃CR₁^CreER；5XFAD)小膠質細胞與f/f;AD (Pkm2^f/f；5XFAD)小膠質細胞的比較(圖4B)。小膠質細胞Pkm2敲除導致PKM1水平和ATP產生顯著增加(圖S3)。與此一致的是，海馬細胞外通量測定顯示，與WT小膠質細胞相比，Pkm2敲除的小膠質細胞耗氧量(OCR)顯著升高(圖S3D)。這些結果表明，小膠質細胞Pkm2敲除導致PKM1的代償性表達和糖酵解向OXPHOS的代謝轉變。我們還檢測到Pkm2敲除后的小膠質細胞細胞內乳酸水平、Pan Kla和H4K12la水平以及Hif-1a和Ldha的表達均顯著降低，無論是體外還是體內(圖4C和S4A-S4E)。注意，在添加乳酸鹽后，這些下降又恢復了(圖S4A-S4E)。額外的免疫熒光分析證實，Pkm2缺乏降低了小膠質細胞中H4K12la的水平，斑塊鄰近小膠質細胞的降低尤為明顯(圖4D)。

AD是一種慢性神經炎性疾病，伴有小膠質細胞異常激活，逐漸導致小膠質細胞功能障礙。我們用抗PKM2和抗Aβ(抗6E10)抗體對小膠質細胞(抗iba1)進行了共染色。AD腦切片中具有強PKM2信號的小膠質細胞異常激活；這些表型在cKO;AD腦切片中不明顯(圖4E)。WB顯示，與f/f;AD提取物相比，cKO;AD海馬提取物中Iba1水平明顯降低，進一步支持小膠質細胞增生(圖4F)。

對小鼠腦切片進行Iba1、Aβ(抗6E10)和TMEM119(一種小膠質細胞特異性穩態蛋白)的聯合染色。正如預期的那樣，Iba1⁺TMEM119^?表明，f/f;AD小鼠的Aβ斑塊鄰近小膠質細胞偏離了穩態階段小膠質細胞(圖S5)。然而，Aβ斑塊周圍的小膠質細胞在cKO;AD小鼠中部分重新表達了TMEM119(圖4G)。qPCR表明，與f/f;AD小膠質細胞相比，從cKO;AD小鼠中分離出的小膠質細胞顯著增加了小膠質細胞穩態基因如Tmem119, P2ry12和Tgfb1的表達，而促炎基因包括Tnf-a, iNos和Il-1b的表達顯著降低(圖4H)。這些發現表明，通過基因刪除PKM2來中斷糖酵解/H4K12la/PKM2環可抑制5XFAD小鼠的小膠質細胞促炎激活。

圖4：PKM2基因缺失可改善5XFAD小鼠的小膠質細胞功能障礙和神經炎癥

(8) PKM2特異性消融術可改善5XFAD小鼠的Aβ病理

小膠質細胞介導的神經炎癥促進了Aβ的產生并促進了Aβ斑塊的形成。我們采用TS染色法檢測f/f;AD和cKO;AD小鼠腦切片中的Aβ斑塊，探討糖酵解/H4K12la/PKM2環的中斷是否會影響AD小鼠的Aβ病理。小膠質細胞特異性消融Pkm2導致包括皮質和海馬在內的大腦區域Aβ斑塊含量顯著降低(圖5A和5B)。與我們的TS染色結果一致，WB顯示cKO;AD小鼠的皮質和海馬中Aβ水平與f/f;AD小鼠相比顯著降低(圖5C)。此外，與f/f;AD小鼠相比，cKO;AD小鼠營養不良神經突的總面積(lamp1陽性免疫染色信號)顯著減少(圖S6)，表明AD小鼠小膠質細胞Pkm2缺失具有神經保護作用。這些結果表明，通過破壞PKM2功能來中斷糖酵解/H4K12la/PKM2環可以改善5XFAD小鼠的Aβ病理。

圖5：5XFAD小鼠小膠質細胞中PKM2特異性消融可改善Aβ病理并改善空間學習和記憶

(9) PKM2特異性消融術可改善5XFAD小鼠的空間學習和記憶

Morris水迷宮實驗檢測空間學習記憶能力發現，與f/f;AD小鼠相比，cKO;AD小鼠的學習能力顯著提高(即在訓練試驗中，cKO;AD小鼠對平臺的逃避潛伏期更短；圖5D)。cKO;AD小鼠在探針試驗期間首次進入目標(平臺)的潛伏期明顯縮短，進入目標的次數明顯增加，在目標象限的時間明顯增加(圖5E-5H)，結果表明cKO;AD小鼠的記憶保持能力更好。值得注意的是，游泳速度在小鼠之間沒有明顯差異(圖5I)，這表明cKO;AD小鼠這些表型的減輕不是由于運動能力的改變。總的來說，通過阻斷PKM2來中斷糖酵解/H4K12la/PKM2環可以挽救5XFAD小鼠的空間學習和記憶缺陷。

(10) 藥理抑制PKM2可降低5XFAD小鼠的Aβ負荷和小膠質細胞活化程度

為了測試藥理學上抑制PKM2是否對AD有任何保護作用，我們每隔一天給4個月大的5XFAD小鼠腦室內注射PKM2抑制劑(紫草素或化合物3K)，持續1個月，之后對大腦進行AD相關病理分析。PKM2的化學抑制顯著降低了海馬和皮質等腦區Aβ斑塊的含量(圖6A和6B)。此外，這兩種抑制劑也明顯降低PKM2水平，降低反應性小膠質細胞的程度，并部分逆轉5XFAD小鼠小膠質細胞的變形蟲形態(圖6C和6D)。化學抑制PKM2也顯著抑制了低聚抗體刺激的原代培養小膠質細胞中IL-6和TNF-a等促炎因子的水平(圖6E)。總之，通過抑制PKM2功能來中斷小膠質細胞中的糖酵解/H4K12la/PKM2環可以被理解為減輕AD神經炎癥的潛在策略。

圖6：藥理抑制PKM2可減輕5XFAD小鼠的Aβ負荷和神經炎癥程度

結論：糖酵解/H4K12la/PKM2正反饋回路加劇了AD的小膠質細胞激活和功能障礙。通過阻斷PKM2阻斷該環可降低H4K12la水平，從而在轉錄上抑制一組糖酵解基因，從而降低乳酸水平。除了我們證明這種抑制可以改善小膠質細胞功能障礙之外，我們的研究還表明，抑制這種惡性反饋循環代表了治療AD的潛在治療策略。

參考文獻：Pan, R. Y., He, L., Zhang, J., Liu, X., Liao, Y., Gao, J., Liao, Y., Yan, Y., Li, Q., Zhou, X., Cheng, J., Xing, Q., Guan, F., Zhang, J., Sun, L., & Yuan, Z. (2022). Positive feedback regulation of microglial glucose metAβolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell metAβolism, 34(4), 634–648.e6. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.02.013