脈絡膜新生血管（CNV）是嚴重視力喪失的主要原因，在許多眼部疾病中都有發生，尤其是新生血管年齡相關性黃斑變性（nAMD）。環狀RNAs（circRNAs）是一類新的內源性非編碼RNA，參與了糖尿病和癌癥內皮細胞功能障礙的調節。今天小編帶大家了解最新發表于雜志“Theranostics”上的文章“Circular RNA-ZBTB44 regulates the development of choroidal neovascularization”。本研究旨在探討circRNA-ZBTB44（cZBTB44）在CNV發病中的作用。

    在本研究中，我們采用定量聚合酶鏈反應檢測CNV發生過程中cZBTB44的表達。采用體外分離蛋白B4染色、HE染色和脈絡膜發芽試驗，探討cZBTB44在CNV發生發展中的作用。另外，通過體外內皮細胞增殖、遷移和成管實驗，探討cZBTB44在血管生成中的作用。通過生物信息學分析、RNA免疫沉淀分析、熒光素酶分析和體外研究，探討cZBTB44介導CNV發生的機制。
結果：
1.cZBTB44在激光誘導CNV損傷和缺氧應激內皮細胞中的表達上調
    我們首先通過熒光原位雜交（FISH）和qRT-PCR檢測cZBTB44是否在脈絡膜視網膜內皮細胞（RF/6A）中表達。結果表明，cZBTB44主要在RF/6A細胞的細胞質中表達（圖1A-B）。然后，我們通過用RNase R處理來自RF/6A細胞的總RNA來評估cZBTB44的穩定性。結果顯示cZBTB44對RNase R消化具有抗性，而線性ZBTB44的mRNA很容易降解（圖1C）。我們利用激光光凝技術建立了小鼠CNV模型，并測定了cZBTB44在激光誘導的體內CNV膜中的表達是否發生了改變。qRT-PCR檢測顯示，CNV病變中cZBTB44的表達明顯高于對照脈絡膜（圖1D）。缺氧被認為是CNV形成的重要驅動因素。將RF/6A細胞置于含CoCl2的培養基中模擬缺氧條件。我們觀察到，CoCl2治療導致cZBTB44表達以時間依賴的方式增加（圖1E）。

2.cZBTB44調節CNV在體內的發育
    我們設計了三種不同的短發夾RNA（shRNAs）來沉默cZBTB44的表達。兩種shRNA可顯著降低小鼠脈絡膜cZBTB44的表達（圖2A）。我們選擇shRNA2是因為它具有更高的消聲效率。為探討cZBTB44在激光誘導CNV中的作用，采用玻璃體腔注射cZBTB44-shRNA2。用免疫熒光法檢測脈絡膜平坦區新生血管面積。結果表明，cZBTB44沉默導致激光誘導的CNV小鼠模型CNV損傷面積減少，與貝伐單抗、阿非貝西普等抗VEGF藥物對CNV的抑制作用相似。此外，cZBTB44沉默聯合抗血管內皮生長因子藥物比其單獨作用更有效地抑制CNV的形成（圖2B-C）。同樣，HE染色分析顯示cZBTB44沉默導致CNV病變長度和面積減少（圖2D-F）。這些結果表明cZBTB44參與了CNV的體內形成。

3.cZBTB44在體外調節CNV的發育
    我們利用體外模型進一步研究了cZBTB44在脈絡膜血管生成活性中的作用。實驗分為4組：cZBTB44沉默組、cZBTB44高表達組、shRNA干擾組和未處理組。在第1天、第3天和第5天，對這些外植體的脈絡膜毛細血管發芽區域進行了拍照。cZBTB44沉默導致發芽面積減少（圖3A-I）。相比之下，cZBTB44的過表達導致了更大的血管萌生區域（圖3J-L）。脈絡膜萌動區的定量結果如圖3所示?？傊鲜鼋Y果表明cZBTB44參與了體外模型中CNV的調節。

4.cZBTB44在體外調節內皮細胞功能
    內皮細胞被認為是眼部新生血管疾病的主要參與者。因此，我們研究了cZBTB44在體外內皮細胞中的作用。我們設計了三種不同的siRNAs用于cZBTB44沉默。siRNA1和siRNA3轉染均能顯著降低cZBTB44的表達（圖4A）。在基礎條件和缺氧條件下，我們檢測了cZBTB44沉默對RF/6A細胞功能的影響。siRNA3沉默cZBTB44導致細胞活力降低（圖4B），增殖減少（圖4C），細胞遷移和試管形成減慢（圖4D-E）。

5.cZBTB44作為miRNA海綿調節內皮細胞功能
    cZBTB44主要表達于RF/6A細胞的胞漿中。我們推測cZBTB44可能通過充當miRNA海綿來調節基因表達。環狀RNA相互作用體數據庫和序列分析表明，cZBTB44中miR-578有兩個潛在的結合位點（圖5A-B）。成熟miRNA的功能鏈被Ago2組裝成RNA介導的沉默復合物RISC，從而引導RISC沉默靶mRNA。我們采用RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，與對照組相比，cZBTB44富含含Ago2的免疫沉淀，即免疫球蛋白G（IgG）免疫沉淀（圖5C）。miR-578在含ago2的免疫沉淀物中的表達水平明顯高于IgG免疫沉淀物(圖5C)。這些結果也提示cZBTB44和miR-578主要定位于RF/6A細胞的胞漿中。RNA-FISH也證實了cZBTB44和miR-578之間的共同定位（圖5D）。接下來我們將cZBTB44序列插入熒光素酶報告子（LUC-cZBTB44）的下游。miR-578模擬轉染降低了LUC-cZBTB44的熒光素酶活性，但對LUC-cZBTB44突變體的熒光素酶活性沒有影響（圖5E）。miR-578模擬轉染不影響cZBTB44和ZBTB44 mRNA的表達水平（圖5F），表明miR-578對cZBTB44和ZBTB44 mRNA的降解沒有影響。使用生物素偶聯的miR-578，我們觀察到與陰性對照組（生物素化miR-335）相比，miR-578捕獲組分中cZBTB44的富集程度更高（圖5G）。我們還觀察到，與陰性對照組（生物素化cZNF532）相比，cZBTB44捕獲組分中miR-578的富集程度更高（圖5H）。上述結果提示cZBTB44可作為miR-578在內皮細胞中的海綿。

6.cZBTB44/miR-578相互作用參與內皮細胞功能的調節
    由于miR-578被cZBTB44誘導，我們研究了miR-578在調節RF/6A細胞功能中的作用。miR-578模擬轉染降低了RF/6A細胞的增殖、遷移和成管能力，而cZBTB44過表達可以挽救miR-578模擬轉染對RF/6A細胞功能的影響（圖6A-G）。結果提示，cZBTB44/miR-578的相互作用參與了內皮細胞功能的調控。

7.cZBTB44/miR-578相互作用參與CNV的發育調控
    我們研究了miR-578在CNV發生發展中的作用。agomir注射上調miR-578可能模擬cZBTB44沉默對CNV形成的影響，顯示出明顯的體內外抗血管生成活性（圖7A-D）。我們進一步探討了外源cZBTB44的加入是否能抑制miR-578的抑制作用。結果表明，外源cZBTB44可以阻斷miR-578在CNV中的調節（圖7A-D）。因此，我們認為cZBTB44/miR-578相互作用參與了CNV的發育調控。

8.cZBTB44-miR-578-VEGFA/VCAM1網絡調節內皮血管生成作用
    我們利用Targetscan數據庫預測miR-578的靶基因。miR-578模擬轉染顯著抑制了RF/6A細胞中VEGFA和VCAM1的表達（圖8A）。隨后，用熒光素酶報告法驗證miR-578對其血管生成靶點的直接調控。miR-578模擬轉染降低了含有VEGFA和VCAM1靶序列的報告構建物的熒光素酶活性（圖8B）。這些結果表明miR-578是VEGFA和VCAM1在RF/6A細胞中的直接調節因子。我們還發現cZBTB44沉默顯著降低了VEGF和VCAM1的表達（圖8C）。進一步的功能分析顯示，VEGFA和VCAM1的過度表達可以部分緩解cZBTB44沉默對RF/6A細胞增殖、遷移和管形成的抑制作用（圖8D）。在激光誘導的CNV中，VEGFA和VCAM1的表達顯著上調（圖8E）。cZBTB44沉默顯著降低了VEGFA和VCAM1的表達（圖8F）。因此我們認為cZBTB44-miR-578-VEGFA/VCAM1串擾參與了內皮細胞功能的調節。

9.cZBTB44在CNV患者中的臨床意義
    我們采用qRT-PCR方法檢測了nAMD患者房水（AH）和血漿中cZBTB44的表達水平。AH，眼內的一種重要體液，被認為與許多眼部疾病有關。眼底照片顯示nAMD患者有灰黃色新形成的脈絡膜血管，伴有視網膜下出血和視網膜內液體（圖9A）。光學相干斷層血管造影（OCTA）顯示黃斑部有一個異常的新生血管網，主要分布在外視網膜和脈絡膜毛細血管（圖9B-C）。nAMD患者的AH中cZBTB44、VEGFA和VCAM1的表達顯著上調，而年齡相關性白內障（ARC）和青光眼患者的AH沒有增加（圖9D-F）。總之，這些結果提示cZBTB44可能參與了新血管性AMD的發病機制。

結論：
    這項研究揭示了cZBTB44在CNV發展中的作用。cZBTB44沉默抑制CNV在體內和體外的發育，抑制內皮細胞的增殖、遷移和試管形成。cZBTB44作為內源性miR-578海綿調節CNV的發育。這些結果將有助于更好地了解CNV的形成，開發新的cZBTB44靶向治療新生血管引起的眼部疾病。