隨著新的治療策略的不斷發(fā)展，基于細(xì)胞療法已成為有前途的選項一些疾病。盡管干細(xì)胞具有有益的作用，但它們的臨床應(yīng)用面臨許多挑戰(zhàn)，包括勞動量大，成本高和安全性等問題。研究表明，成年干細(xì)胞的再生能力主要是由于它們的旁分泌活性，這種分泌是通過這些分泌物來實(shí)現(xiàn)的。減輕細(xì)胞療法問題同時保留細(xì)胞治療益處的一種可行方法是使用分泌組或條件培養(yǎng)基代替實(shí)際細(xì)胞。肺球細(xì)胞分泌蛋白（LSC-Sec）和外泌體（LSC-Exo）的治療效果優(yōu)于源自間充質(zhì)干細(xì)胞的同類藥物。

技術(shù)路線：

結(jié)果：
1. 細(xì)胞分泌蛋白可減輕博來霉素誘導(dǎo)的纖維化和細(xì)胞凋亡
   為檢測LSC-Sec對肺修復(fù)和纖維化的影響，使用大劑量博來霉素建立肺纖維化（PF）模型，炎癥在注射后第7天達(dá)到峰值，并在第9天左右轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維化階段，在炎癥階段結(jié)束后的第十天開始干預(yù)，以確保處于疾病模型的治療階段。霧化處理后發(fā)現(xiàn)所有組均顯示出血性壞死，LSC-Sec或MSC-Sec治療后出血壞死減少。由于Bleo會誘導(dǎo)DNA損傷，因此我們研究了分泌物治療對凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)LSC-Sec處理導(dǎo)致肺部細(xì)胞凋亡減少。LSC-Sec和MSC-Sec都通過保留肺泡上皮結(jié)構(gòu)和減少膠原蛋白沉積來減少纖維化，只有LSC-Sec能減少纖維化區(qū)域并使肺泡上皮損傷恢復(fù)至對照水平。

2. 吸入分泌蛋白可促進(jìn)血管和肺泡修復(fù)
    肺泡上皮由AT1和AT2細(xì)胞組成以防御損傷和維持體內(nèi)平衡。AT1標(biāo)記AQP5的免疫染色顯示LSC-Sec處理能夠逆轉(zhuǎn)由Bleo引起的上皮損傷，LSC-Sec處理組中AQP5蛋白增加，表面活性蛋白C（ProSPC +）陽性AT2細(xì)胞的增殖增加。這種反應(yīng)在MSC-Sec處理組中仍然發(fā)生，但程度較低，與PBS組無顯著差異。只有LSC-Sec處理能夠增加PF肺中vWF +脈管系統(tǒng)的表達(dá)。LSC分泌組顯示出αSMA下降趨勢，MMP2的表達(dá)呈增加趨勢，促炎因子IL-4表達(dá)呈下降趨勢。

3. LSC分泌蛋白治療二氧化硅引起的肺纖維化
    為檢驗LSC-Sec的作用是否可應(yīng)用于其他肺損傷模型，我們使用公認(rèn)的二氧化硅誘發(fā)肺纖維化模型，二氧化硅滴注后第28天開始治療。任何治療組中凋亡細(xì)胞均無差異，LSC-Sec能顯著降低纖維化的嚴(yán)重程度，二氧化硅誘導(dǎo)的結(jié)節(jié)周圍的纖維化組織強(qiáng)度較小且分布較少，但均持續(xù)存在；還減少了膠原蛋白沉積并減少肺泡上皮損傷。所有組中，兩種肺泡細(xì)胞標(biāo)記物均無明顯下降，但LSC-Sec能通過促進(jìn)ProSPC ⁺ AT2細(xì)胞表達(dá)并維持AQP5 ⁺ AT1細(xì)胞群體來減少肺泡上皮損傷。

4.LSC-分泌蛋白和外泌體的蛋白質(zhì)組成
    我們使用來自三個不同供體LSC的集合分泌蛋白，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢查其蛋白質(zhì)組，并將其與報道的干細(xì)胞分泌物組進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)在共有的蛋白質(zhì)中，有29.6％的注釋為具有已知分泌膜受體的細(xì)胞外蛋白，而47.5％的注釋為具有未知分泌途徑的胞質(zhì)蛋白，且發(fā)現(xiàn)在LSC-Sec中75％的細(xì)胞質(zhì)蛋白是通過目前未知的機(jī)制或途徑從細(xì)胞釋放的蛋白。
當(dāng)LSC裂解時，大多數(shù)蛋白質(zhì)組由細(xì)胞質(zhì)蛋白（65％）和僅5％的細(xì)胞外蛋白組成。當(dāng)將在LSC-Sec中檢測到的細(xì)胞質(zhì)蛋白與裂解細(xì)胞進(jìn)行比較時，我們發(fā)現(xiàn)在分泌組中被分類為細(xì)胞質(zhì)蛋白的222種蛋白中只有56種（25％）來自潛在的裂解或死細(xì)胞。在三個供體中鑒定出102種常見細(xì)胞外蛋白中，大多數(shù)是生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白，約一半也在LSC-Exo中鑒定出，許多蛋白都與生物粘附、細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和血小板脫粒有關(guān)。

5. LSC外泌體的治療作用
    檢測外泌體的功能作用，發(fā)現(xiàn)所有分泌蛋白和外泌體治療組在維持正常肺結(jié)構(gòu)，減少纖維化，減少肺細(xì)胞凋亡和膠原沉積 方面均顯示出治療效果。肺αSMA蛋白水平?jīng)]有明顯下降趨勢，LSC-Sec和LSC-Exo治療可減輕肺泡上皮和血管損傷，并減少纖維化反應(yīng)。

 
6. 外泌體治療改善肺功能和外泌體miRNA分析
    在進(jìn)行吸入博來霉素的同時進(jìn)行了多項肺功能測試，發(fā)現(xiàn)吸氣量、阻力、順應(yīng)性、滯后面積以及強(qiáng)制呼氣量與強(qiáng)制肺活量的比率均呈下降趨勢。表明所有動物的肺功能持續(xù)受損，造成肺損傷，導(dǎo)致組織硬度和彈性反沖增加。通過分泌蛋白和外泌體治療僅部分恢復(fù)肺功能。LSC-Sec、LSC-Exo或MSC-Exo治療后，吸氣能力和呼吸順應(yīng)性均顯著改善，僅使用LSC-Exo治療，呼吸阻力才明顯恢復(fù)，而滯后面積和FEV / FVC比均無明顯變化。
LSC-Exo和MSC-Exo的進(jìn)行小RNA測序分析其miRNA組成差異，發(fā)現(xiàn)有600多個獨(dú)特miRNA，總共有42個miRNA在這兩個外泌體之間差異表達(dá)，在LSC-Exo中最上調(diào)的miRNA中有hsa-miR-99a-5p和hsa-miR-100-5p，并且是miR-99家族成員。抗纖維化的miR-30a-3p也明顯上調(diào)。