鐵死亡是一種由鐵和脂質氫過氧化物引發的細胞死亡，并由GPx4預防。 (Fer-1)比酚類抗氧化劑更有效地抑制鐵死亡。先前對Fer-1抗氧化效率的研究采用了動力學試驗，其中重氮化合物產生被抗氧化劑清除的氫過氧自由基。然而，這種反應，考慮到斷鏈效應，對于描述亞鐵和脂質氫過氧化物依賴的過氧化的抑制作用幫助很小。
    最近，一篇名為“Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1”的文章在雜志Redox Biology上發表，闡述了在亞鐵存在的情況下，GPx4和Fer-1通過不同的機制產生最相關的抗鐵死亡效應，即起始脂質氫過氧化物的消失。

摘要：
    通過清除脂質氫過氧化物自由基，產生脂質氫過氧化物，亞鐵引發新的過氧化鏈式反應。研究者們發現，當Fer-1抑制脂質體中由鐵和微量脂質氫過氧化物引發的過氧化反應時，由預先存在的微量氫過氧化物產生的氧化物的模式實際上與在沒有抗氧化劑的情況下觀察到的徹底過氧化后觀察到的模式相同。這支持了Fer-1的抗鐵死亡活性實際上是由清除脂質過氧化氫生成的亞鐵與其它重排產物所產生的烷氧基自由基的觀點。值得注意的是，Fer-1在抑制鐵依賴的脂質過氧化的同時不被消耗。新出現的概念是，是亞鐵本身減少了Fer-1自由基。這一點得到了電分析證據的支持，即Fer-1與鐵形成復合物，并通過鈣黃綠素的熒光在細胞中進一步證實，表明Fer-1的存在降低了不穩定的鐵。通過量子力學計算，還研究了鐵抑素-鐵配合物的偽催化循環的概念，證實了Fer-1還原烷氧基自由基模型和亞鐵還原Fer-1自由基。
技術總結：

一. Ferrostatin-1和trolox具有明顯不同的脂質過氧化抑制效率，而具有相同的斷鏈抗氧化作用
    比較trolox和Fer-1的抗氧化能力：I）產生脂質過氧化氫自由基的重氮化合物；II）抗壞血酸亞鐵從脂質體中存在的微量脂質過氧化氫引發過氧化反應。將含有0.1 mM磷脂的擠出脂質體分散體(SLPC 18：0/18：2和SLPE 18：0/18：2，比例1：1)引入氧合細胞，并在存在FER-1或trolox的情況下與空氣平衡。通過添加：ABIP或FeSO4-抗壞血酸啟動過氧化。
    圖1A表明，在ABIP存在的情況下，Fer-1和trolox具有相同的斷鏈能力(IC50分別=1.66μM和1.86μM，圖1C)。相反，當Fe2+引發過氧化時，FER-1比trolox更有效(IC50分別=0.017μM和7.2μM，圖1B和C)。結論：在模擬FT中發生的脂質過氧化模型中，脂質氫過氧化物自由基的清除效率并不反映抗氧化能力。

圖一：鐵或重氮在脂質體中誘導脂質過氧化的抑制。初始耗氧速率比R/R0與Trolox(藍色空心圓)和FER-1(紅色實心圓)濃度的關系符合Eq方程。含有0.1mM磷脂(SLPC：SLPE/1：1)，不同量的trolox或Fer-1的脂質體溶液被8 mM ABIP(A組)或30μM抗壞血酸和4μM FeSO4(B組)在0.1MTris，0.15MKCl，pH7.0，在37°C時氧化。報告(C)從面板A和B計算的IC50值。

二. 脂質氧化產物的脂質組學分析
    鑒定基于MS/MS光譜，結合保留時間。作為基本參考化合物，使用ALOX15產生的氫過氧化物，并用Gpx4-GSH還原。表1報告了檢測到的最相關(>0.1%)氧化物種的列表。

表一：用氧化脂質組學鑒定SLPC的氧化種類。所有物種都是由亞油酸產生的。在PLPC、SLPC和PLPE中檢測到相同的物種。通過保留時間和MS/MS進行鑒定。
    當脂質體被重氮化合物或Fe2+過氧化時，脂質過氧化產物的模式有很大的不同。30分鐘后，約20%的磷脂被氧化修飾，氫過氧化物占重氮化合物氧化產物的70%，而鐵引發的過氧化物不超過30%。

圖二：重氮化合物或Fe2+/抗壞血酸誘導的脂質氧化模式。在時間0(T0)和用ABIP8 mM或Fe2+4μM加抗壞血酸30μM孵育30分鐘后，測量相對于1-硬脂酰基-2-亞油酰基-sn-甘油-3-磷脂啉(SLPC)的含有0.1 mM磷脂的新鮮脂質體懸浮液(SLPC：SLPE/1：1)的氧化脂質模式。在插圖中總結了總氧化種類占SPLC總量的百分比(左)和脂氫過氧化物占氧化種類總數的百分比(右)。數值代表20個獨立實驗的平均±標準偏差。
    當Fe2+引發過氧化時，30分鐘后脂質氫過氧化物仍是主要的脂質過氧化產物，但也產生大量的環氧酮、環氧羥基、酮、羥基、環氧氫過氧化物。Fe2+誘導的脂質過氧化的時間過程(圖3A)顯示所有的過氧化產物逐漸增加，而脂質體制劑中最初存在的脂質氫過氧化物(t=0)在暴露于Fe2+時突然減少，然后逐漸增加。這一結果完全符合脂質烷氧基自由基引發脂質過氧化的機制。當鐵依賴的脂質過氧化被FER-1抑制時(圖3B)，脂質體中存在的脂質氫過氧化物消失，產生一系列氧化物種，其模式與不抑制過氧化時觀察到的模式相同(圖3A)。這一證據與fer1最相關的反應是清除激活脂質過氧化的PL-O?的觀點一致。相反，對PL-OO?的清除，即斷鏈效應，與增殖競爭，但也穩定了可逆的氧添加，生成新的過氧化氫，鐵由此引發新的過氧化鏈反應。

圖三：Fe2+誘導SLPC氧化模式的時間進程，以及Fer-1效應。含有0.1mM磷脂(SLPC：SLPE/1：1)的脂質體懸浮液與Fe2+4μM和抗壞血酸30μM在不存在(A)或存在(B)0.5μM FER-1的情況下孵育30分鐘。在添加前(T0)和添加后0.5，2，10，30分鐘提取樣品。在插圖中，總結了總氧化種類占SPLC總量的百分比(左)和脂氫過氧化物占氧化種類總和的百分比(右)。數值表示3個獨立實驗的平均±標準偏差。

圖四：Fe2+誘導脂質過氧化機制的示意圖。

三. Ferrostatin-1可以抑制過氧化反應而不被消耗
    Fer-1在抑制鐵誘導的過氧化時沒有被消耗。0.5μM FER-1在鐵驅動的過氧化氫分解過程中不消耗，即使在存在15μM脂質氫過氧化物的情況下也是如此(圖5)。假設：與烷氧基相互作用產生的fer1自由基可以被還原回來。驗證：亞鐵是這個反應中的電子供體。首先通過電分析測量Fer-1與鐵的相互作用，然后通過量子力學計算氧化還原過程的能量學來驗證該假設。其次，通過鈣黃綠素熒光證實了Fer-1與鐵在細胞中形成復合物。

圖五：脂質過氧化分解和鐵存在下的Fer1消耗。含有0.1mM磷脂(SLPC：SLPE/1：1)的溶液在pH7.4的0.1MTris，0.15MKCl中，通過用Alox15預處理60min富集氫過氧化物，在37℃下用0.5 μMFer-1，30μM抗壞血酸和4μMFeSO4處理。用質譜對總PL-OOH(s正方形■) 和FER-1(三角形▼) 的時間過程進行了定量?？瞻资蔷彌_區中的FER-1(圓形●).

四. Fer-1與鐵相互作用的電分析
    在90%甲醇和LiClO4緩沖液(0.1M)中進行微分脈沖伏安法(DPV)測量。將Fe2+或Fe3+逐步加入到100μM FER-1，并記錄產生的電流。在鐵的存在下，FER-1的兩個氧化峰都向更正的電位(陽極位移)移動(圖6A和B)。峰電位的這些位移(ΔVP=VpFer-1+Fe-VpFer-1)取決于FER-1/Fe比率，滿足預期的飽和動力學(圖6C和D)。得到的雙曲線方程與實驗數據吻合較好。

圖六：鐵和亞鐵離子對fer-1陽極峰值電位值的影響。在沒有和存在不同的亞鐵(A)和鐵離子(B)離子濃度的情況下，Fer-1的微分脈沖伏安圖顯示了由鐵引起的fer-1峰電位值的陽極移動。示出了峰電位(ΔVp=VpFer-1+Fe-VpFer-1)在Fe2+/FER-1(C)和Fe3+/FER-1(D)上的移動圖；連續線是通過非線性回歸分析對實驗數據進行雙曲線方程最佳擬合的結果。

五. Fer-1的氫原子轉移(HAT)機制
    DFT分析表明，FER-1可以通過N個孤對與鐵結合。在模型中，配位球被三個Cl陰離子飽和，因此總分子電荷為-1。值得注意的是，因為只有仲胺N與鐵結合，所以配合物是四配位的(圖7A)。它的電子基態是五重奏，特征是四個電子在金屬中心平行自旋。該配合物可以通過氫原子轉移(HAT)機制減少自由基。在計算分析中，分別使用CH3O·和CH3OO·作為脂烷氧基和氫過氧自由基(PL-O·和PL-OO·)的模型。在仲胺N位上的自由基形成比在伯胺N位上更穩定。通過分子內電子轉移，鐵(II)被氧化成鐵(III)，N原子帶負電荷。在這個復合體中，總的多重性是一個六重體，并且五個未配對的電子定位在鐵的中心上。隨后，在與水分子反應時，FER-1被質子化，形成五配位配合物(圖7B)。Gibbs自由反應能表示在苯和水中計算的驅動HAT從FER-1進行自由基還原的整個過程的熱力，以分別模擬非極性和極性環境，分別為48.3和10.9kcal mol-1(指CH3OO·自由基)和28.3和-9.1 kcal mol-1(指CH3O·自由基)。這表示FER-1的清除能力及其對烷氧基而不是氫過氧自由基的偏好(圖7C)。

圖七：在M06-L/6-31G(d，p)，LanL2DZ理論水平上，對鐵抑素-1鐵配合物的分子結構進行了全面優化。Fer-1/FeII(A)和Fer-1/FeIII(B)復合物分別示于(A)和(B)中。在(C)中，描繪了FER-1清除脂質烷氧基自由基(PLO·)和亞鐵還原減少fer-1自由基的示意圖。

六. Ferrostatin-1減少細胞中不穩定的鐵庫
    基于細胞化學鈣黃綠素-AM(鈣黃綠素-乙酰氧基甲酯)法測定細胞“不穩定鐵池”(LIP)的尺寸。以DMSO為對照，增加fe -1的濃度以加入測定。為了證明該程序的有效性，以100μM deferasirox作為陽性對照。與完全消除細胞LIP的鐵螯合劑不同，20μM Fer-1有效地降低不穩定的鐵庫濃度不超過50%(圖8)。這一結果，連同通過DVP和DFT獲得的證據，支持了Fer-1可以與至少部分細胞LIP相互作用的觀點。這進一步證實了Fer-1與鐵形成絡合物的結論，并間接支持了Fe2+還原FER-1自由基的理論機制證據。

圖八：Fer-1結合不穩定鐵池(LIP)的鐵。對于對照組，處理細胞的相對LIP表達為鈣黃綠素平均熒光強度(MFI)。以Deferasirox 100μM孵育的細胞為基線。數值為2個實驗的平均±標準偏差(SD)，一式三份。