Pumilio（PUM）蛋白是高度保守的RNA結合蛋白家族的成員，該家族在轉錄后調節許多生物體中的基因表達。但是，它們在胎盤中的作用尚不清楚。胚胎著床時，滋養細胞粘附在母體子宮內膜上，然后侵入母體子宮內膜，最終形成胎盤。目前，在人類胎盤發育過程中發現了兩種主要的滋養細胞譜系:絨毛滋養細胞和外滲滋養細胞（EVTs）。EVT的侵襲是胚胎植入和胎盤形成的重要過程。EVT侵襲不充分和子宮螺旋動脈重構受損是子癇前期（PE）發生的啟動因素。本文確定了一種新的RNA調控機制，揭示了在PE發病機理中，調控PUM1 / HOTAIR在滋養細胞入侵中調控的新途徑，并于今年12月發表在Molecular Therapy (IF: 8.402)。
主要結果如下：
1、PE患者滋養細胞中PUM1表達水平升高
   收集妊娠中期絨毛組織，探討PUM1和PUM2在PE發病中的作用，PUM1在PE中的mRNA和蛋白水平均上調（Fig 1A-B）。此外，與HC組相比，早發型PE組和晚發型PE組的絨毛組織中PUM1陽性信號更強（Fig 1C-F）。總之，PUM1在PE患者滋養細胞中高表達。

                                                           圖1 PE患者滋養細胞中PUM1表達水平升高

2、PUM1抑制HTR-8細胞的增殖和侵襲
   如圖2所示，與對照組相比，干擾PUM1后HTR-8細胞的增殖和侵襲能力顯著升高，表明PUM1抑制HTR-8細胞的增殖和侵襲。

                                                                 圖2 PUM1抑制HTR-8細胞的增殖和侵襲

3、在絨毛外滋養細胞外植體培養模型中PUM1弱化了EVTs的入侵和遷移能力
   為進一步研究PUM1在滋養細胞侵襲中的作用，從新鮮妊娠早期胎盤組織中分離出細胞滋養細胞(CT)和侵襲性滋養細胞(EVT)。采用qRT-PCR檢測妊娠早期胎盤絨毛組織及CT、EVT細胞的PUM1 mRNA表達水平，結果發現，EVT細胞中PUM1 mRNA的表達水平低于CT細胞，表明PUM1可能在體內調控EVT的侵襲中發揮重要作用。
   然后研究PUM1是否對滋養細胞的體外遷移能力有影響。從妊娠前3個月(妊娠6-10周)的胎盤中取出胎盤絨毛，分成兩組，在涂有基質的培養皿中培養。培養24h后，siCtrl和siPUM1組之間沒有觀察到顯著差異。體外培養72h后，siPUM1處理的外植體比siCtrl處理的外植體遷移得更遠（圖3A和3B）。全量免疫熒光染色顯示了胎盤絨毛中PUM1的沉默效率（圖3C和3D）。
   為了進一步闡明PUM1對滋養層細胞入侵的調控，從健康的絨毛中獲得新鮮外植體，并將其分為兩組。結果表明，lenti-PUM1處理的外植體的遷移能力低于lenti-ctrl處理的外植體（圖3E和3F）。綜上，PUM1抑制EVT入侵并支持PUM1可能是PE的關鍵介體的觀點。

                                                               圖3 PUM1減少了外植體中滋養層的生長

4、HOTAIR是PUM1在滋養層中的一個下游基因
   為了闡明PUM1在PE發病機制中調控滋養細胞侵襲的分子機制，將HTR-8細胞轉染siCtrl或siPUM1后培養48h的細胞進行lncRNA測序，得到178個差異表達lncRNA，與對照相比，siPUM1中101個上調77個下調（圖4A）；其中22個lncRNA的表達水平發生了顯著變化 (圖4B)，經qRT-PCR驗證，有12個的表達模式一直（圖4C）。用PUM1過表達質粒轉染HTR-8細胞，qRT-PCR結果顯示，lncRNAs HOTAIR、HAGLR和CTD-2228K2.7在PUM1過表達組滋養細胞中表達較低；與此相反，MEG3、SNHG1、SNHG6和linc01085在PUM1過表達的滋養細胞中顯著升高(圖4D)。之后，使用RIP實驗，結果發現只有HOTAIR顯著富集（圖4E）。此外，敲低PUM1可顯著促進HOTAIR在HTR-8細胞中的表達，而過表達PUM1可降低HOTAIR的表達(圖4F和4G)?？傊琍UM1在胞質內與HOTAIR特異性相互作用，調節HOTAIR的表達。

                                                              圖4 PUM1下調滋養細胞中HOTAIR的表達

5、PUM1在滋養細胞中調節HOTAIR的表達和穩定性
   為了進一步闡明PUM1調節滋養細胞中HOTAIR表達的潛在分子機制，根據UGUARAUA共有序列，在HOTAIR的第六個外顯子區域（0.5 2.3 kb）中預測了四個PUM1結合位點，這些PUM1結合位點稱為A，B，C和D（圖5A）。熒光素酶結果顯示，在對照組和PUM1沉默下，HTR-8細胞中MUT C的熒光素酶活性，特別是MUT D報告質粒的熒光素酶活性顯著增加（圖5B和5C），表明HOTAIR第六外顯子區域中的位點C和D是PUM1的潛在結合位點。RIP結果顯示，與IgG組相比，HOTAIR的C和D位點顯著降低了抗PUM1組的HOTAIR富集（圖5D），這些表明，HOTAIR的C和D位是結合PUM1蛋白的主要位點。RNA親和純化實驗證實PUM1與HOTAIR特異性相互作用（圖5E）。此外，轉染siPUM1后，HOTAIR的半衰期較長，但當用過表達PUM1的質粒轉染細胞時，HOTAIR的半衰期較短（圖5F和5G），揭示了PUM1對HOTAIR RNA穩定性的強烈影響。綜上，PUM1在轉錄后調控HOTAIR。

                                                          圖5 PUM1是HOTAIR滋養細胞中重要的RNA結合蛋白

6、HOTAIR在PE中下調表達并與PUM1表達呈負相關
   作者此前發現，HOTAIR通過激活PI3K- AKT信號通路來促進滋養細胞侵襲。實驗發現，PUM1敲低或HOTAIR過表達增強了Ser473的AKT磷酸化，而PUM1過表達或HOTAIR敲低大大降低了AKT的磷酸化。此外，用HOTAIR過表達加PUM1過表達處理HTR-8細胞可以逆轉PUM1過表達對AKT磷酸化的影響。相反，用HOTAIR siRNA加PUM1 siRNA處理HTR-8細胞也明顯逆轉了HOTAIR敲低對AKT磷酸化的作用（圖6A和6B）。
   此外，與對照組相比，過表達PUM1的HTR-8細胞和原代滋養細胞中侵襲細胞的數量明顯減少，而HOTAIR的過表達逆轉了由PUM1過表達引起的對滋養細胞入侵的影響（圖6C-6F）。進一步驗證PE患者和HCs中滋養細胞中HOTAIR和PUM1 mRNA的表達水平，和預期一致，與HC組相比，PE組的滋養細胞中PUM1 mRNA的水平明顯較高，而HOTAIR的水平顯著較低（圖6G和6H）。線性相關分析表明，絨毛組織中HOTAIR水平與PUM1 mRNA水平呈負相關（圖6I）。綜上所述，PUM1 / HOTAIR / p-AKT途徑在調節滋養細胞入侵中具有重要的功能。

                                                       圖6 PUM1/HOTAIR/AKT通路參與調節滋養細胞的侵襲
   總之，本文表明PUM1是HOTAIR表達和滋養細胞功能的關鍵調控因子。首先，在PE中，PUM1上調，HOTAIR下調。其次，HOTAIR是滋養層遷移和入侵的有效調節因子，而在PE患者中，該過程不受控制。最后，AKT磷酸化的下調伴隨著PUM1過表達后遷移和侵襲的減少。