導語:
    細胞外泡(EVs)在正常的肺生理中起著重要的作用，通過細胞間通訊維持氣道內的穩態。ev包括外泌體和微囊泡，并以其磷脂雙層為特征。EVs被認為是一種新型的疾病循環生物標志物，由不同類型的細胞釋放。EV miRNAs的生物分析對于開發可用于COPD診斷、預后和治療的生物標志物具有巨大的轉化潛力。近期，一篇名為“Small RNA-sequence analysis of plasma-derived extracellular vesicle miRNAs in smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease as circulating biomarkers”的文章在雜志Journal of extracellular vesicles（IF=11）上發表，首次報道血漿來源的EV miRNAs是一種新的循環肺部疾病生物標志物。

技術路線:

研究結果:
1.人血漿衍生EV的分離和表征鑒定
    對6名非吸煙者、6名吸煙者和8名慢性阻塞性肺病患者的EV/外泌體分離和特征進行了全面分析，并對人血漿來源的EV進行了小RNA測序。對等離子體衍生的ev進行了透射電鏡(TEM)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)和可調電阻脈沖傳感(TRPS)，其范圍在50-150 nm之間, TEM分析證實了從非吸煙者、吸煙者和COPD患者的血漿樣本中分離出的杯狀ev的形態ogy。非吸煙者、吸煙者和慢性阻塞性肺病患者EVs濃度的數據顯示，在顆粒大小分布或總顆粒數方面沒有顯著差異，但在三組中均顯示外泌體的大小范圍內富含vesi- cles。進行了微BCA蛋白質分析量化exosomal總額之間相對比較孤立的EV出現在所有三組。從非吸煙者、吸煙者和COPD患者中分離出的等離子體衍生EVs中，TSG- 101、rab5b和Alix的外泌體標記物富集。從人血漿樣品中分離的ev不含calnexin或GRP94，表明內質網蛋白未受污染。

 
 
2.EV標記證明被人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)所攝取
    使用來自血漿的EV非吸煙組和吸煙者組使用ExoGlow-membrane EV labelling kit試劑盒進行標簽。將標記的ev加入到BEAS-2B細胞中，以驗證人支氣管上皮細胞對血漿來源的EV的吸收。紅色熒光標記的電動汽車被確定在BEAS-2B細胞,表明EVs的吸收。生活共焦顯微鏡圖像從不同地區獲得24小時后的后處理貼上EVs BEAS-2B細胞陽性顯示約50 - 60%的標簽EVs不吸煙和吸煙組。

 
 
3.輸入Read校準和小RNA生物型映射           
    Exosomal RNA濃度在人類plasma-derived EVs不吸煙,吸煙者和COPD患者59和310 pg /μl之間不等，各種小RNA生物型的百分比分布對人類基因組的reads進行分類。每組小RNA生物型的平均reads總數在110萬到140萬之間。我們觀察到一個不同的模式和生物型豐富的百分比分布非吸煙者,吸煙和慢性阻塞性肺病患者。microRNA(24.9 - 31.9%, 15.9 22.9%和58.9 6.4%),tRNA(23.3 - 24.3%, 26.5 23.8%和11.1 2.5%)和protein_coding(25.2 - 16.9%, 25.7 16.7%和10.2 2.8%)生物型的最高濃縮生物型非吸煙者,吸煙和慢性阻塞性肺病患者,分別。misc_RNA和lincRNA的生物型分別為3.0% - 8.2%和0.5% - 2.9%。最后,piRNAs (0.6 - 2.6%), Mt_rRNAs (0.1 - 0.6%), Mt_tRNAs(0.1%)、核內小RNA(0.1 0.5%)和snoRNA(0.1 0.3%)至少代表生物型的非吸煙者,吸煙和慢性阻塞性肺病患者。生物型分布百分比為個人所有三組樣本表示在圖2(表3)。

4.非吸煙者、吸煙者與COPD患者的miRNA比較
    從所有三組(非吸煙者、吸煙者和COPD患者)中總共識別出329種不同的miRNA。只有219個miRNA序列的平均讀數大于5 /百萬。139個、115個和198個總miRNA分別存在于非吸煙者、吸煙者和慢性阻塞性肺病患者的等離子體衍生外體RNA中。比較吸煙者和COPD時，兩組之間共有111個miRNA。非吸煙者、吸煙者和COPD組患者均有一定數量的miRNAs(分別為17、3和65)，這些miRNAs是各組特有的。在比較不吸煙者和吸煙者時發現了五種差異表達的miRNA。當我們比較非吸煙者和慢性阻塞性肺病患者時，發現了21種不同具體表達的miRNA。此外，當對比吸煙者與COPD時，發現15個miRNA有差異表達。在非吸煙者與吸煙者之間以及吸煙者與COPD之間的比較中，只發現了一個共同的差異表達的miRNA;在非吸煙者vs. COPD和吸煙者vs. COPD比較中共鑒定出24種miRNA，三種不同的兩兩比較中均未發現相同的miRNA。使用三個比較組中發現的前20個最豐富的miRNA來分析這些獨特的miRNA。結果顯示17 microRNA豐富的存在在所有三組,1獨特的microRNA的每個非吸煙者和吸煙者組和2獨特的microRNA在COPD患者組,前20名中有豐富的microRNA。在不吸煙者與smo- kers、不吸煙者與COPD、吸煙者與COPD成對比較中，miRNA的表達有顯著差異，采用層次聚類方法進行聚類分析。通過測試統計和P值來選擇每對比較中識別出的候選miRNA。此外，我們還使用調整后的P值P < 0生成熱圖和兩兩比較的層次聚類分析。0 1。只有6個獨特的miRNA在非吸煙者與COPD和吸煙者與COPD兩兩比較中有差異表達。我們沒有觀察到任何miRNA候選體在非吸煙者與吸煙者兩兩比較中使用調整后的p值有差異表達。

 

5.非吸煙者、吸煙者與COPD患者tRNAs的比較
所有三組(非吸煙者、吸煙者和COPD患者)中總共識別出25個不同的tRNA。通過分析三組的平均讀計數，我們發現了六種不同的tRNA: tRNALys、tRN AGly、tRN ACys、tRN AAla、tRNAGluand tRNAValto是本研究發現的25種富含等離子體源EV tRNA中最豐富的tRNA片段。在非吸煙者和吸煙者中有差異。比較非吸煙者和COPD時，發現了5個差異表達的tRNAs(兩個獨特的tRNALysand tRNAGlu;三種常見的tRNAGly, tRN異型tRNA)和在吸煙者與COPD組中的比較(兩種獨特的tRNALeu和tRNAMet;三種常見tRNAGly t R N ATyrand tRNA),和所有的轉運RNA被發現在普遍不吸煙者和吸煙者不吸煙與慢性阻塞性肺病和吸煙與慢性阻塞性肺病成對比較。非吸煙者與吸煙者、非吸煙者與COPD、吸煙者與COPD兩兩比較中，tRNAs有顯著性差異表達，采用層次聚類方法進行聚類分析。在25個富集tRNAs中，5個tRNAs在非吸煙者與COPD和吸煙者與COPD中存在差異表達，并且在25個富集tRNAs中存在兩兩獨特和三種常見的兩兩比較。我們沒有觀察到任何tRNA候選基因在非吸煙者和吸煙者兩兩比較中均有差異表達。 

6.非吸煙者、吸煙者與COPD患者的piRNAs比較
    從所有三組(非吸煙者、吸煙者和COPD患者)中總共識別出34種不同的piRNAs。通過分析所有三組的平均read數，發現三種不同的piRNAs: piro -016658、piro -016659和piro -019825，它們是血漿衍生EV富含34種piRNAs中最豐富的。無法在不吸煙者和吸煙者中檢測到任何獨特的差異表達的piRNAs。當比較非吸煙者與COPD組(pi -012753)和吸煙者與COPD組(pi -016735)時，發現一個獨特的piRNA表達差異。在com- mon中僅發現一個piRNA (pi -020813)，非吸煙者與吸煙者、非吸煙者與COPD、吸煙者與COPD兩兩比較中存在顯著性差異的piRNAs表達，發現了兩種piRNAs(一種獨特的:12 I. K. SUNDAR等人的piR-012753和一種常見的:piR-020813)在非吸煙者與非吸煙者、吸煙者與COPD兩兩比較時存在差異。

 
7.miRNA的功能過表達分析(ORA)和基因集富集分析(GSEA)
    對差異表達的miRNA(非吸煙者vs.吸煙者、非吸煙者vs. COPD、吸煙者vs. COPD)進行了功能性過表達分析(ORA)和基因集富集分析(GSEA)。發現差異表達的重要濃縮microRNA從屬于類別的非吸煙者和吸煙者基因本體論(去)和目標基因。奧拉非吸煙者的差異表達miRNA與慢性阻塞性肺病屬于類似的識別重要的充實等途徑。奧拉在非吸煙者與慢性阻塞性肺病的比較顯示,濃縮的smoking-mediated信號通路如細胞凋亡信號通路,通過趨化因子和細胞因子信號通路介導的炎癥,氧化應激反應,這與各自相關基因本體和疾病。miRNA的功能過表達分析吸煙者和 COPD也顯示出明顯的miRNA靶點富集，miRNA表達(不吸煙與慢性阻塞性肺病com -半成品)顯示出上調。使用非吸煙者與吸煙者配對比較中差異表達的miRNA進行GSEA。由于這些比較中差異表達的miRNA數量較少，我們沒有獲得任何富集數據。當我們進行GSEA利用非吸煙者的差異表達miRNA與慢性阻塞性肺病,兩類(通路和基因本體)顯示富集,觀察到在奧拉數據分析以及免疫細胞(CD19, CD3和CD56),發現新通路在GSEA途徑豐富利用吸煙與慢性阻塞性肺病的差異表達miRNA成對比較。這包括p53通路反饋環2、參與DNA損傷反應(DDR)的miRNA、G1對S細胞周期的控制、肌動蛋白骨架的調節和DNA損傷反應。

8. miRNA的數據庫搜索/分析
    在數據庫中搜索了調整后的顯著性p值(非吸煙者與COPD之間的miR-151a-5p;miR-151b、miR-335-5p、miR-320d、miR-628-3p miR-877-5p和miR-937-3p)和吸煙者與COPD (miR- 22-3p、miR-99a-5p、miR-320b、miR-320d、miR-877-5p和miR-937-3p)的比較。EV miRNA、ExoCarta、Vesiclepedia和miRDB數據庫的搜索結果證實，上面列出的大多數miRNA之前都在血清/血漿、腦脊液和/或結直腸can- cer細胞來源的外泌體/EV中得到了富集/鑒定。此外，一些miRNAs也在尿液中被發現，其中一個在神經母細胞瘤細胞來源的exo- somes/ ev中被發現。

9.通過實時熒光定量PCR和nanostring分析對選定的RNA-seq miRNA進行驗證
    使用人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)，加入或不加入CSE(0.5%) 3天，從條件培養基中分離外泌體/ ev到RNA-seq分析中鑒定的有效的選定miRNA。選擇了11種不同的miRNA (miR-let-7a-5p, miR- let-7i-5p, miR-29a-3p, miR-92a-3p, miR-99a-5p, miR- 100-5p, miR-151b, miR-184, miR-375, miR-486-5p和miR-584-5p)。 qPCR結果顯示，11個miRNA中有8個在BEAS-2B細胞的CSE來源的外泌體中表達顯著增加控制。其余三個microRNA并沒有顯示出顯著改變他們exosomal CSE之間microRNA的表達水平與對照組。選擇了11種不同的miRNAs (miR-let-7a-5p、miRlet-7i-5p、miR-23b-3p、miR-25-3p、miR-29a-3p、miR-92a-3p、miR-99a-5p、miR-103a-3p、miR-128-3p、miR-151b和miR-375)。qPCR分析未發現U937細胞的外泌體與cse來源的外泌體相比有顯著變化。數據表明，在吸煙者和COPD患者中發現的一些系統miRNA生物標志物(血漿來源的外體miRNA)有可能成為新的環狀外體miRNA生物標志物。通過使用nSolver分析軟件4.0對樣本中100個高表達miRNA的總數進行NanoString分析顯示，兩組之間有13個miRNA存在差異表達。與對照組相比，cse處理組中有5個miRNA被下調(miR-574-5p、miR- 575、miR-146a-5p、miR-320e和miR-181a-5p)， 8個miRNA被上調(miR-15a-5p、miR- 130a-3p、miR-19b-3p、miR-99a-5p、miR-30a- 3p、miR-25-3p和miR-32-5p)和。值得注意的是, 在CSE處理組中發現的13個miRNA中有兩個(miR-99a-5p和miR-25-3p)差異表達。

總結:
    總之，從非吸煙者、吸煙者和COPD患者中分離和鑒定血漿來源的EVs/外泌體。我們使用小RNA測序分析來鑒定ncRNA類的富集，如miRNA、tRNA、lincRNA、piRNAs、snRNAs、snoRNAs等生物類型。特別關注miRNA、tRNAs和piRNAs的差異表達(DESeq2)，以及單獨用于進一步分析(包括驗證)的miRNA。選擇了差異顯著的兩兩比較的miRNA，并通過ev的qPCR分析和使用NanoString技術的人類miRNA面板對對照組與經cse處理的BEAS-2B細胞的總RNA進行了進一步驗證。基因集富集分析揭示了在調節慢性阻塞性肺病患者和吸煙者的cyto- kine信號(炎癥)、細胞外基質和組織重塑的生物學通路中起關鍵作用的幾個靶點。未來的研究正在進行中，以確定EV生物標記物使用不同的體液，如血清/血漿、BAL液、尿液，來自非吸煙者、吸煙者和COPD患者，以發現局部與系統循環的EV生物標記物之間可能的關系。