人類基因組中大約50%的DNA可以轉錄為RNA，其中只有2%能夠翻譯成蛋白質(mRNA)，其余98%不能翻譯成蛋白質，這些不能翻譯成蛋白質的RNA被稱之為非編碼RNA。常見的具有調控作用的非編碼RNA包括環狀RNA（circRNA）、微小RNA（miRNA）及長鏈非編碼RNA(lncRNA)等。非編碼RNA在國自然基金申請上非編碼RNA可是大熱門，前有miRNA，后有lncRNA與circRNA。今天我們講最近幾年新出現的“小老弟”circRNA，pubmed檢索到的文獻數量呈指數級增長，circRNA也入選了科睿唯安聯合中科院發布《2019研究前沿》。去年國自然中標的標書中有73項與circRNA相關，預測2020年中標數仍會上漲，預計到達100例左右。

   今天我們將一篇關于circRNA的m6A甲基化修飾促進結直腸癌肝轉移的新機制的文章，該文章題名為：N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis，發表在Nature Communications期刊上。

1、在CRC組織中分析circRNA失調，circNSUN2在CRC侵襲性中的作用
   首先通過circRNA芯片檢測了結直腸癌組織中circRNAs的表達情況。接下來，比較九種circRNA在腫瘤組織中的表達與來自97名CRC患者的匹配的正常組織中的表達。分析發現位于CRC染色體5p15.31上的circRNA_103783的高表達提示患者總體生存率（OS）較差，circRNA_103783高表達與淋巴結轉移呈正相關。circRNA_103783源自NOP2 / Sun RNA甲基轉移酶家族成員2（NSUN2）位點的第4和5個外顯子區域；因此稱其為circNSUN2。原發性CRC，尤其是肝轉移（LM） CRC患者中，circNSUN2的水平經常被上調；患有LM的CRC患者的血清中circNSUN2水平顯著上調。

2、CRC中circNSUN2的表征
   接下來驗證了circNSUN2為環狀RNA，通過引物和RNA酶驗證。核質分離PCR和FISH發現circNSUN2主要位于細胞質中，但也存在于細胞核中。這些結果共同表明，circNSUN2是在CRC中表達的豐富而穩定的circRNA。

3、CircNSUN2促進PDX模型中的CRC細胞轉移
   鑒于circNSUN2在CRC侵襲性中具有重要的臨床意義，作者研究了circNSUN2在CRC細胞轉移中的體內功能。在肝轉移模型或肺轉移模型中，PDX CRC細胞中circNSUN2敲低后，腫瘤轉移被顯著抑制。過表達circNUSN2注射TC71細胞的裸鼠在肝臟或肺中轉移結節明顯增加。表明對CRC轉移的調節作用直接來自circNSUN2。體外研究（CRC細胞遷移、Transwell和三維（3D）反向侵襲試驗）均顯示敲除circNSUN2可顯著抑制CRC細胞的侵襲。

4、YTHDC1促進m 6 A修飾的circNSUN2的細胞質輸出
   為了探索circNSUN2調控CRC惡性腫瘤的潛在分子機制，通過RNA pulldown和質譜分析驗證了YTHDC1和IGF2BP2作為circNSUN2結合蛋白。進一步的RIP實驗表明，與對照IgG相比，抗YTHDC1抗體沉淀的復合物中circNSUN2富集。MeRIP實驗表明circNSUN2的外顯子4-5連接序列也高度富集在m6A沉淀中，證實了circNSUN2中的存在m6A修飾。突變circNSUN2中GAACU m6A序列YTHDC與circNSUN2的相互作用能力降低。核質分離PCR和FISH顯示，沉默YTHDC1會顯著增加核circRNA含量。這些結果表明，YTHDC1可以與circNSUN2結合，從而促進circNSUN2以m6A依賴性的方式從細胞核輸出至細胞質。

5、CircNSUN2通過CAUCAU序列與IGF2BP2相互作用
   RNA Pull-down實驗，觀察到circNSUN2拉下豐富IGF2BP2蛋白；RIP實驗也證明了IGF2BP2和circNSUN2之間的相互作用。通過IF-FISH實驗，證實了內源表達的circNSUN2和IGF2BP2在細胞質中的共定位。表明circNSUN2 / IGF2BP2在細胞質中形成RNA-蛋白質復合。RIP實驗顯示IGF2BP2的KH3-4雙結構域與circNSUN2特異性結合，表明KH3-4雙結構域負責募集circNSUN2。CircScan 數據庫分析發現，IGF2BP2在circNSUN2的外顯子5–外顯子4交界位點與circNSUN2結合，也就是CAUCAU序列。通過體外RNA-EMSA，驗證了IGNS2BP2 與circNSUN2相互作用需要內部的CAUCAU序列。

6、CircNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2復合物可穩定HMGA2 mRNA
   經數據庫篩選，鑒定了21個與IGF2BP2結合的mRNA。考慮到circNSUN2促進轉移進展，篩選出十個與轉移相關的基因作為circNSUN2的潛在靶標。qRT-PCR和WB驗證HMGA2是circNSUN2的靶基因。通過BLAST分析，發現circNSUN2內部的AAACA位點直接結合到HMGA2的3'UTR。RNA Pull-down驗證了circNSUN2和HMGA2之間的相互作用。進一步發現敲除circNSUN2會顯著降低HMGA2的mRNA穩定性，從而導致HMGA2表達降低。circNSUN2敲低時，HMGA2 44的下游靶標CXC基序趨化因子受體4（CXCR4）的表達也被下調。circNSUN2在促進IGF2BP2和之間的相互作用中起關鍵作用HMGA2，并且增強的mRNA穩定性HMGA2通過circNSUN2 / IGF2BP2 /形成HMGA2 RNA-蛋白三元復合物。

7、CircNSUN2通過HMGA2途徑促進CRC的LM
   體內模型表明，通過注射circNSUN2-nockdown PDX CRC細胞而形成的肝臟中轉移結節減少，通過HMGA2的過表達而得以很大程度上恢復。通過Transwell分析、3D反向侵襲分析和3D形態發生Matrigel培養物進行的體外分析進一步證明，HMGA2的強制表達在circNSUN2沉默后在功能上拯救了減少的細胞侵襲和遷移。為了進一步揭示circNSUN2調控在CRC中的臨床相關性，檢查了97名CRC患者中circNSUN2，HMGA2和CXCR4的表達水平。發現，circNSUN2的表達水平與HMGA2和CXCR4轉錄物的表達水平呈正相關。值得注意的是，HMGA2和CXCR4的表達水平預示著較差的CRC患者OS。
   接下來，有檢查從相同的20名CRC患者中通過手術獲得的PC和匹配的LM組織中HMGA2和CXCR4的表達水平。結果表明，HMGA2和CXCR4的表達上調在LM中比在PC中更為普遍。

   好了今天就講到這，下回帶大家看點別的。再見！！！