導語：
外泌體能夠攜帶反映疾病狀況的多種遺傳分子，在細胞通訊過程中扮演著一個“快遞員”的重要角色，由于其較低的免疫原性，致瘤性和更易于管理，因此外泌體已成為疾病細胞療法的一種有前途的新選擇。外傷性股骨頭壞死(ONFH)是導致股骨頭塌陷的一種情況，其主要治療方法為全髖關節置換術，預后較差。但是外泌體卻能為外傷性ONFH的治療提供了一種可能的策略。
技術路線：
1.通過微陣列分析，篩選外傷性ONFH相關表達數據集獲得差異表達基因(DEGs)和差異表達miRs，
2.收集外傷性和非外傷性外傷性腦脊液瘤患者，并進行隨訪。
3.純化和鑒定了BM-MSCs來源的外泌體，然后與外泌體共培養HUVECs。
4.驗證miR-224-3p在外傷性ONFH中的功能作用是通過異位表達、耗竭和再通過報告基因實驗確定。
5.評估內皮細胞增殖、遷移、侵襲能力和血管生成
6.通過芯片分析驗證在ONFH中miR-224-3p表達以及證實FIP200是miR-224-3p的靶基因。
7.驗證外泌體mir -224- 3p對內皮細胞增殖、遷移、侵襲能力、血管生成和FIP200表達。
8.最后證明FIP200過表達促進了血管生成
研究結果：
1、BM-MSCs發現有間質表型
   在光學顯微鏡下,觀察到,BMMSCs通道4是同質漩渦的形狀。流式細胞儀檢測,積極的CD90率是97.4%,CD34是0.091%,表明BM-MSCs特定的間質表型,但沒有造血表型。

2、外泌體被血管內皮細胞內化
   Nanosight分析表明，純化的外泌體直徑范圍在30到100 nm之間。通過透射電鏡發現，純化后的外泌體呈圓形，直徑約50 nm，說明囊泡的主要成分可能是外泌體。檢測到外泌體特異性標志物CD9、CD63和CD81。孵育后，標記為綠色熒光的外泌體被內在化，主要定位于內皮細胞的胞質中，表明外泌體被血管內皮細胞內在化。

3、外傷性ONFH-Exo促進內皮細胞增殖和血管生成
   將HUVECs分別與創傷性ONFH-Exo和con-Exo孵育，以確定外泌體對血管內皮細胞的影響。進行了EdU和mtt分析。外傷性ONFH-Exo較conExo明顯促進內皮細胞增殖。此外，我們使用基質凝膠法評估血管生成能力。結果表明,與con-Exo相比,創傷ONFH-Exo增加分支點的數量和總管的長度。劃痕試驗表明,與con-Exo相比,創傷ONFH-Exo表現出顯著增加區域的細胞遷移。與此同時,Transwell化驗的結果表現出更多的入侵細胞創傷ONFH-Exo比con-Exo。最后,上述結果提示創傷性ONFH-Exo具有促進血管生成的作用。

4、MiR-224-3p通過調節FIP200影響外傷性ONFH
   從GSE89587表達數據集中篩選出差異表達的miRs(補充表S1)，選取前10個下調的miRs繪制表達熱點圖。利用microRNA數據整合門戶(mirDIP)、microRNA靶相互作用數據庫(miRTarBase)和DIANA數據庫預測miR224-3p的靶基因，分別得到267、113和1031個靶基因。此外，從外傷性ONFH的表達數據集GSE74089中篩選出631個DEGs。然后，將DEGs與miR-224-3p的靶基因進行比較，繪制Venn圖。確認存在一個交集基因，即RB1誘導卷曲線圈1 (RB1CC1)。RBCC1在外傷性ONFH中的差異表達可被miR-224-3p調控。GSE74089表達數據的前30個DEGs的表達熱圖示外傷性ONFH患者RB1CC1表達高于對照組。定量RT-PCR (qRT-PCR)結果證實，外傷性ONFH前5個miRs (miR-4711-3p、-122-5p、-122-3p、-3191- 5p、-224-3p)表達下調，其中miR-224-3p表達最多，約為80%。RB1CC1也被稱為FIP200。這些結果表明，miR-224-3p在創傷性ONFH中調節FIP200。

5、 miR-224-3p的下調促進創傷性ONFH血管生成
   mir -224-3pmimic或抑制劑被送入HUVECs進行功能分析。模擬NC組、抑制劑NC組與對照組在edui陽性細胞、OD值、分支點數量、總管長度、細胞遷移面積、侵襲細胞數量等方面差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比,EdU-positive細胞和內皮細胞減少的OD值mir - 224 - 3 - P模擬組,而他們顯著增加mir - 224 - 3 - P抑制劑組(P< 0.05)。然而,管形成能力減少themir - 224 - 3 - pmimic集團,而這顯然增加了mir - 224 - 3 - P抑制劑組(P<0.05)。相對于模擬數控,抑制劑數控,和對照組,miR-224-3p模擬組細胞遷移面積和侵襲細胞數量減少，而miR-224-3p抑制劑組則相反(P<0.05)。這些數據表明，miR-224-3p的下調可能促進創傷性ONFH血管生成。

6、 MiR-224-3p下調通過靶向FIP200促進血管生成
   在線預測網站揭示了MiR-224-3p和FIP200之間存在一個結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結果表明轉染miR-224-3p和FIP200野生型后，熒光素酶活性顯著下降。qRT-PCR結果顯示，與mimicNC組相比，miR-224-3p mimic組miR-224-3p水平顯著升高;然而，與抑制劑NC組相比，miR-224-3p抑制劑組對miR-224-3p表達有顯著的抑制作用(P<0.05)。Western blot分析發現，與mimicNC相比，miR-224-3p模擬組中FIP200和VEGF表達被抑制，而miR-224-3p抑制劑組中FIP200和VEGF表達被促進(P<0.05)。構建FIP200過表達載體。qRT-PCR和Western blot結果顯示，與載體組相比，FIP200過表達組FIP200和VEGF的表達明顯增加(P<0.05)。與con- Exo組相比，外傷性ONFH-Exo組mir -224- 3p表達明顯降低(P<0.05)， FIP100表達升高(P<0.05)。這些結果表明miR-224-3p通過負調控FIP200抑制血管生成。

7、下調miR-224-3p可促進體內血管生成
   建立了創傷性onfh大鼠模型，模型組股骨頭組織內可見大面積壞死骨，空洞集中。對照組可見骨細胞和罕見的空洞。術后1天，從外傷性ONFH患者骨髓間充質干細胞肌注分離的外泌體和miR-224-3p inhibitor或mimic。HE染色顯示，外傷性ONFH-Exo+ control組、外傷性ONFH-Exo+ mimicNC組、外傷性ONFH-Exo+抑制劑組中，股骨頭以凋亡骨為主，活骨與死骨交替存在。外傷性ONFH-Exo + miR-224-3p模擬組主要表現為死骨和少量骨細胞，而外傷性ONFH-Exo + miR-224-3p抑制劑組主要表現為正常骨細胞，表現為罕見的死骨。外傷性ONFH-Exo +對照組、外傷性ONFH-Exo +模擬NC組和外傷性ONFH-Exo +抑制劑NC組FIP200和VEGF蛋白水平無明顯差異(P>0.05)。FIP200的蛋白質含量和VEGF在創傷性顯著降低ONFH-Exo + mir - 224 - 3 - P模仿組與創傷ONFH-Exo +模擬數控組相比,而他們是顯著增加traumaticONFH-Exo + mir - 224 - 3 - P抑制劑組與創傷ONFH-Exo +抑制劑NC組(P<0.05)。這些研究結果表明,抑制mir - 224 - 3 - P表達ONFH老鼠體內促進血管生成。

總結：
   mm - mscs分泌miR-224-3p抑制外泌體，調節外傷性ONFH血管生成。在ONFH中，miR-224-3p在來源于骨髓間充質干細胞的外泌體中的表達被下調，從而促進FIP200的表達，從而促進內皮細胞的血管生成、遷移和侵襲，促進VEGF的表達，進而促進血管生成以預防ONFH。骨髓間充質干細胞的外泌體作用于內皮細胞。外泌體中miR- 224-3p可抑制FIP200的表達，從而抑制內皮細胞的增殖、微血管生成和血管生成。當創傷性ONFH發生時，來自BM-MSCs的外泌體中miR-224-3p的表達下調，從而上調FIP200，促進內皮細胞的增殖、遷移和血管生成。
   總之，骨髓間充質干細胞來源的外泌體miR-224-3p的下調，可促進內皮細胞增殖，遷移，侵襲能力，下調miR-224-3p水平通過上調FIP200促進創傷性ONFH的血管生成。此研究結果強烈建議mir - 224 - 3 - p可以作為一種潛在的分子治療創傷性ONFH的目標，但需要更大的樣本量的研究來驗證目前的實驗結果，以開發臨床價值。