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METTL3介導的HDGF mRNA m6A修飾促進胃癌進展

欄目:最新研究動態 發布時間:2020-03-05
m6A甲基化被認為是真核mRNA中最豐富、最普遍的修飾。作用包括調控mRNA的穩定性、剪切、轉運、定位和翻譯和RNA蛋白質交互......

   m6A甲基化被認為是真核mRNA中最豐富、最普遍的修飾。m6A修飾的作用包括調控mRNA的穩定性、剪切、轉運、定位和翻譯和RNA蛋白質交互。在過去的幾年中,m6A調節因子的生物學功能被報道與干細胞分化、組織發育、晝夜節律周期和腫瘤進展相關。然而,m6A的生物學意義以及其在人類胃癌(GC)中的潛在調控機制仍不清楚。那么小編為大家介紹一篇最近發表在期刊Gut上的文章:“METTL3-mediated m6A modification of HDGF mRNA romotes gastric cancer progression and has rognostic significance”。在本研究中,我們揭示了METTL3介導的m6A修飾在GC中的生物學作用,并提出METTL3可能是一種新的預測GC進展的生物標志物和治療靶點。

結果:
1.METTL3表達升高與胃癌患者預后不良相關

   為了闡明m6A修飾在胃癌中的功能作用,我們首先檢測了28個胃癌組織和正常胃粘膜的m6A RNA水平。通過dot blot和ELISA檢測,我們發現GC組織中的m6A RNA水平明顯升高(圖1A,1B)。其中甲基轉移酶METTL3在GC中顯著上調(圖1C,1D)。另外,我們還發現,METTL3 mRNA水平升高的GC患者總體生存較差(圖1E)。與上述結果一致,經western blot檢測發現,86%人胃癌組織中METTL3蛋白水平明顯高于正常胃組織(圖1F)。這些結果在胃癌組織芯片中得到證實,經免疫組化染色顯示,胃癌組織中METTL3的表達較正常胃組織明顯增加(圖1 G,H)。此外,METTL3表達增高的胃癌患者5年總生存期較差(圖I)。多元回歸分析表明,METTL3是一個獨立的預測患者的預后的標志GC(圖1 J)。為了進一步評估METTL3表達的預測能力,我們進行了時間依賴的接受者操作特征曲線分析,結果顯示,臨床風險評分(TNM期)和METTL3風險評分的聯合作用遠遠大于單獨的GC隊列中的任何一個(圖1K)。綜上所述,m6A修飾和METTL3水平在GC中有所升高,METTL3可能是胃癌患者的獨立預后因素。

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2.p300介導的H3K27ac激活GC中METTL3的轉錄
   為了探索METTL3在GC中的高表達機制,我們首先通過UCSC基因組生物信息學位點分析了METTL3啟動子的修飾。如圖2A所示,在METTL3的啟動子區發現大量的H3K27乙酰化(H3K27ac)信號,提示METTL3可能受染色質乙?;{控。然后,我們用靶向P300的組蛋白乙酰轉移酶抑制劑C646處理HGC-27細胞,結果顯示METTL3表達明顯下降,呈時間和劑量依賴性,HGC-27細胞未表現出明顯的細胞毒性(圖2B-D)。使用western blot檢測,我們發現C646處理后H3K27ac和METTL3蛋白水平下降(圖2E)。接下來,我們使用特定的siRNAs敲除P300(圖2F),發現P300的敲除顯著降低了METTL3的mRNA和蛋白水平(圖2G,H)。此外,染色質免疫沉淀實驗結果表明,METTL3的啟動子區域在P300結合和H3K27ac信號中富集,P300的敲除可以顯著降低METTL3啟動子中H3K27ac信號的富集(圖2I,J)。這些數據證實,p300介導的METTL3啟動子H3K27ac活化可能是METTL3上調的部分原因(圖2K)。

說明: D:\Documents\QQEIM Files\2853119522\FileRecv\MobileFile\Image\}GC](R7QUM5291`@XD278JI.png



3.METTL3促進GC增殖和血管生成
   為了研究METTL3在GC中的作用,我們建立了穩定的過表達METTL3的GC細胞(圖3A)。METTL3的上調顯著提高了GC細胞軟瓊脂菌落形成效率(圖3B)和克隆能力(圖3C)。我們還檢測METTL3提升GC細胞增殖是否依賴于其m6A催化活性。與野生型細胞相比,催化突變的METTL3能顯著降低BGC823細胞的m6A水平(圖3D)。此外,METTL3的m6A催化活性對于促進BGC823細胞的克隆能力是必不可少的(圖3E)。我們還建立了穩定的METTL3敲除的GC細胞。在METTL3敲除或敲除后,m6A水平顯著降低(圖3F)。敲除METTL3明顯抑制軟瓊脂菌落形成效率和克隆能力(圖3G,H)。另外,過表達METTL3大大促進腫瘤生長(圖3 I-K)。IHC結果顯示與對照相比,METTL3過表達組的腫瘤組織增加(圖3L)。為了進一步研究METTL3在胃癌血管生成中的作用,我們在體外研究了人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的生長和成管過程。過表達METTL3的BGC823細胞的條件培養基顯著增加了管的形成和HUVEC生長(圖3M)。我們還建立了3例不同類型的胃癌患者的器官樣體模型,進一步驗證METTL3的潛在臨床價值。結果表明,慢病毒過表達METTL3可顯著促進三種不同類型GC器官中GC細胞的增殖(圖3N)。這些數據表明,METTL3可能是一種致癌基因,其m6A催化活性可促進胃癌的增殖和血管生成。

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4.METTL3促進胃癌的體內外轉移
   為了確定METTL3在胃癌轉移中的作用,我們首先在體外進行了遷移和侵襲實驗。數據顯示METTL3的異位表達促進了BGC823和AGS細胞的遷移和侵襲(圖4A,B)。然而,在HGC-27和NCI-N87細胞中,METTL3敲除產生相反的作用(圖4C)。我們進一步評估了METTL3對胃癌體內轉移的影響。通過裸小鼠脾靜脈注射過表達METTL3的BGC823 -熒光素酶細胞及相應的對照細胞。8周后,METTL3的上調明顯促進了GC肝轉移,生物熒光成像顯示,與對照組相比,METTL3的上調明顯促進了GC肝轉移(圖4D-F)。相比之下,METTL3缺乏的NCI-N87細胞顯著抑制了GC肝轉移(圖4G,H)??傊@些結果表明METTL3在促進胃癌轉移中的關鍵作用。

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5.METTL3介導的HDGF mRNA m6A修飾維持了其依賴IGF2BP3的穩定性
   為了明確METTL3促進胃癌進展的分子機制,我們對METTL3過表達和敲除的GC細胞進行RNA測序,并對METTL3過表達的GC細胞和對照細胞進行m6A修飾的RNA免疫沉淀測序(圖5A)。通過分析和細胞實驗確定了HDGF mRNA m6A修飾(圖5B-G)。METTL3過表達的免疫純化RNA中AGACC motif高度富集(圖5H), METTL3上調時HDGF mRNA中的m6A豐度顯著增加(圖5I)。另外,m6A特異性抗體顯著富集了METTL3過表達的HDGF mRNA,而m6A特異性抗體顯著降低METTL3敲除對HDGF mRNA的富集(圖5J)??紤]到m6A修飾對HDGF的mRNA水平具有正向調節作用,我們進而研究m6A修飾是否影響HDGF mRNA的穩定性。結果表明,METTL3過表達時HDGF mRNA水平高度穩定,敲除METTL3則相反(圖5K)。此外,據報道HDGF是IGF2BP1/2/3的高通量測序結果的靶標之一。因此,我們探討了IGF2BP1/2/3對HDGF mRNA穩定的影響。其中只有IGF2BP3的下調顯著抑制HDGF mRNA的表達(圖5L)。與IgG對照抗體相比,IGF2BP3特異性抗體在RIP-qPCR檢測中顯著富集HDGF mRNA(圖5K)。接下來,我們比較了28個GC組織和TCGA數據中HDGF和IGF2BP3的mRNA水平。結果顯示,與正常胃組織相比,胃癌組織中HDGF和IGF2BP3的表達顯著上調(圖5N-Q)。我們還發現METTL3和IGF2BP3的表達與HDGF的表達顯著相關(圖5R,S)。我們也進行腫瘤異種移植研究。結果表明,敲低METTL3、HDGF和IGF2BP3可顯著抑制腫瘤生長(圖5T-V)。

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6.METTL3通過上調HDGF表達來加速GC惡性過程
   為了進一步表征HDGF在GC中的致癌功能,我們設計了三種不同的針對HDGF的siRNAs,并通過qRT-PCR和western blotting證實了它們的敲除效率(圖6A)。HDGF的下調顯著抑制了菌落形成、細胞遷移和侵襲以及HUVEC的生長和成管(圖6B-D)。此外,HDGF重組蛋白挽救了METTL3敲除GC細胞的集落形成能力(圖6E)。與預期一樣,在METTL3過表達的AGS細胞中,HDGF的表達被其特異性的siRNAs敲除,從而顯著抑制了METTL3誘導的GC細胞遷移和侵襲(圖6F)。此外,HDGF的敲低明顯抑制METTL3誘導的 GC體內生長和血管生成(圖6G-J)。因此,我們的數據表明,METTL3通過上調HDGF表達來促進GC惡性進展。

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7.METTL3通過HDGF激活的GLUT4和ENO2的表達來促進GC中的糖酵解
   我們研究METTL3是否調節糖酵解促進GC惡性過程。如圖7A,B所示,上調BGC823細胞中METTL3的表達可顯著增加葡萄糖攝取和乳酸的產生。為了研究HDGF是否能恢復METTL3敲除細胞的糖酵解活性,我們將HDGF過表達質粒轉染到METTL3敲除細胞中。結果表明HDGF過表達可恢復METTL3敲除GC細胞的糖酵解活性,并顯著增加乳酸產量(圖7C)。細胞外酸化速率動力學曲線進一步表明,過表達METTL3的BGC823細胞的糖酵解活性顯著增加,而敲除METTL3的HGC-27細胞的糖酵解活性下降(圖7D,E)。為了進一步研究METTL3調控糖酵解的機制,我們檢測了METTL3過表達和METTL3敲除的GC細胞中與葡萄糖代謝相關的基因的轉錄(圖7F)。我們還檢測了這些基因是否受HDGF調控,并檢測了HDGF敲低GC細胞中與葡萄糖代謝相關的基因(圖7G)。發現只有GLUT4和ENO2的表達水平主要通過上調METTL3而增強。考慮到HDGF可以在細胞核中定位并發揮轉錄調控作用,我們研究了HDGF是否可以轉錄激活GLUT4和ENO2的表達。通過ChIP分析發現,HDGF直接與GLUT4和ENO2的啟動子區結合,而與HK2的啟動子區不結合(圖7H)。IHC結果顯示,METTL3過表達導致AGS腫瘤異種移植中HDGF、GLUT4和ENO2染色明顯增加,而當HDGF敲除時,GLUT4和ENO2表達明顯下降(圖7I)。同樣,在缺乏METTL3的NCI-N87腫瘤異種移植中,HDGF、GLUT4和ENO2染色明顯下降(圖7J)。總之,這些結果表明METTL3/HDGF通過糖酵解途徑促進胃癌的發生和肝轉移。
   為了研究METTL3 / GC HDGF軸在促進糖酵解和血管生成中的臨床意義,我們檢查METTL3,HDGF,GLUT4,ENO2和CD31在GC患者癌組織中的表達。54例胃癌患者中METTL3表達與HDGF、CD31、GLUT4、ENO2表達呈正相關(圖8A,B)。

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結論:
   我們的發現揭示了METTL3在胃癌發生發展中的致癌作用。機制上,METTL3/ HDGF/GLUT4/ENO2軸通過增加糖酵解和血管生成來促進胃癌的發生和轉移。另外,METTL3在胃癌中的表達明顯增加,與胃癌患者預后不良有關。因此,METTL3可能是胃癌潛在的預測和治療靶點。