作為高等生物中常見的RNA修飾方式，m6A修飾不但可以修飾mRNA，也可以修飾一些非編碼RNA，參與多種生物學過程，因此備受科研工作者的矚目。近日，一篇發表在nature communications上面的文章引起小編的注意，與大家一起來看下circRNA的m6A修飾所帶來的神奇效應。

思維路線：

結果:
1.CircNSUN2在結腸癌（CRC）肝轉移（LM）中上調
   circNSUN2源自NOP2 / Sun RNA甲基轉移酶家族成員2（NSUN2）基因座的第4和5外顯子區域，高表達circNSUN2的CRC患者總生存期（OS）較差，circNSUN2在原發性CRC，尤其是在帶LM的CRC中中常上調表達。值得注意的是，與沒有LM的CRC患者相比，circNSUN2在有LM的CRC血清中明顯上調。

2.CRC中circNSUN2的特征
   circNSUN2由外顯子5至外顯子4環化形成的， 轉錄抑制劑actinomycin d處理后，circNSUN2的半衰期超過24小時，而相關的線性轉錄本大約4小時，表明circNSUN2在CRC細胞中更穩定。circNSUN2主要位于細胞質中，但也出現在細胞核中。

3.CircNSUN2在PDX模型中促進CRC細胞轉移
   構建敲低或過表達circNSUN2的TC71 PDX CRC細胞，在PDX CRC中敲除circNSUN2后，腫瘤肝臟或肺轉移明顯受到抑制，過表達circNUSN2的TC71細胞肝臟或肺中轉移結節增加。

4.YTHDC1促進m6A修飾的circNSUN2的細胞質輸出
   探索circNSUN2在調節CRC惡性腫瘤中潛在的分子機制，篩選circNSUN2相互作用蛋白發現YTHDC1和IGF2BP2是circNSUN2結合蛋白，circNSUN2可以用YTHDC1抗體沉淀，由于YTHDC1是一種m6A讀碼器，探索circNSUN2上是否有m6A甲基化，發現circNSUN2的外顯子5?exon 4結合區域在m6A沉淀片段高度富集，確認circNSUN2中的m6A修飾。YTHDC1的沉默增加了核circRNA含量，相比于m6A結合缺陷型YTHDC1，野生型YTHDC1的強制表達，挽救了YTHDC1耗盡引起circNSUN2的細胞質輸出缺陷。YTHDC1可以結合circNSUN2，并因此以m6A依賴性方式促進circNSUN2從細胞核輸出到細胞質。

5.CircNSUN2通過CAUCAU與IGF2BP2相互作用
   circNSUN2能被IGF2BP2蛋白拉下來，在細胞質中可看到circNSUN2和IGF2BP2的共定位。截短單個KH域構建IGF2BP2突變體，發現IGF2BP2的KH3-4雙結構域特異性地綁定到circNSUN2，表明KH3-4雙域負責招募circNSUN2。位于circNSUN2外顯子5-外顯子4交界處的CAUCAU基序是IGF2BP2的結合基序，是IGNS2BP2相互作用所必須的。當IGF2BP2蛋白的濃度為增加，circNSUN2 / IGF2BP2混合物的濃度也增加，CAUCAU基序的突變可明顯降低混合物的濃度。

6.CircNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2復合物可穩定HMGA2 mRNA
   數據分析和實驗驗證確定了HMGA2是circNSUN2的靶標，敲除circNSUN2會降低HMGA2 mRNA的穩定性，HMGA244的下游靶標CXCR4的表達也被下調，circNSUN2的過表達有效上調HMGA2和CXCR4的表達。因為HMGA2可誘導EMT并促進結腸癌進展，進一步評估circNSUN2是否可以增強CRC細胞的EMT表型。circNSUN2的過表達導致上皮標志物E-cadherin的表達下調，間質標記物波形蛋白的表達上調，提示circNSUN2通過HMGA2途徑促進CRC細胞中的EMT。構建野生型HMGA2-3'UTR（HMGA2-WT）或突變型3'UTR（HMGA2-Mut）熒光素酶報道基因，HMGA2-Mut中與circNSUN2交互所需的TGTTT基序已被替換。發現HMGA2-Mut的熒光素酶活性比HMGA2-Mut低一半，敲低circNSUN2抑制了HMGA2-WT的熒光素酶mRNA表達和熒光素酶活性，但HMGA2-Mut沒有被抑制。HMGA2和IGF2BP2共定位在細胞質中，在circNSUN2缺失時，HMGA2 / IGF2BP2 RNA蛋白復合物減少，IGF2BP2表達保持不變。circNSUN2和HMGA2的相互作用需要IGF2BP2的 KH3-4雙結構域。敲低circNSUN2顯著降低HMGA2 / IGF2BP2 RNA-蛋白質相互作用，circNSUN2的過表達顯著增加了IGF2BP2免疫沉淀組分中HMGA2的富集。這些發現證明circNSUN2在促進IGF2BP2和HMGA2相互作用中起關鍵作用，并增強的HMGA2 mRNA穩定性，通過形成circNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2 RNA-蛋白三元復合物。

7.CircNSUN2通過HMGA2途徑促進CRC的LM
   體內模型顯示circNSUN2敲低的 PDX CRC細胞引起的肝轉移性結節減少，可被HMGA2過表達修復，HMGA2過表達可有效抑制沉默circ NSUN2所引起的細胞侵襲遷移減少。HMGA2和CXCR4的表達水平與circNSUN2轉錄本水平為正相關，HMGA2和CXCR4的表達水平預示CRC患者較差的OS。circNSUN2提供潛在的治療目標，拓寬人類CRC的治療選擇。