近日，Li H等人在J Am Chem Soc發表一篇 “Ferroptosis Accompanied by OH Generation and Cytoplasmic Viscosity Increase Revealed via Dual-Functional Fluorescence Probe.”的SCI文章。他們利用自己設計的雙功能熒光探針(H-V)實現了鐵死亡過程中羥基自由基（?OH）產生和細胞粘滯度改變的同時檢測，揭示了鐵死亡伴隨著羥基自由基產生和細胞質粘滯度增加。這是首次報道單個探針就可以實現對鐵死亡過程發生的多種變化進行追蹤、檢測。
   Stockrop等人在2012年新提出的Ferroptosis是一種調控細胞死亡的形式，不同于caspase依賴的細胞凋亡鐵死亡的研究具有重要的生理和病理意義，因為它可能為疾病治療和藥物設計提供新的靈感雖然鐵死亡的分子機制和代謝途徑很復雜，但很明顯，該過程是鐵依賴性的，脂質過氧化物的形成與活性氧（ROS）有關；脂質過氧化物的積累是細胞死亡的主要原因。然而，尚不確定哪種ROS在鐵死亡過程中的脂質過氧化中起關鍵作用。有證據表明，最具活性的ROS羥基（.OH）具有強大的氫吸收能力，能夠引發脂質過氧化反應。此外，生物系統中。.OH的生成主要是通過Fenton反應（Fe2++H2O2）和Haber-Weiss反應（Fe3++O2.-），它們與鐵死亡相似，都與鐵的參與有關。因此，可以合理地假設.OH的過量產生可能是鐵死亡中脂質過氧化的重要原因。然而，關于該主題的研究尚未見報道，盡管在ROS熒光下觀察到總的細胞內ROS增加，但在鐵死亡過程中.OH水平如何變化仍是未知的。例如2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA），等對.OH缺乏選擇性的探針。 另一方面，細胞內黏度是一個基本因素，或者是一些細胞過程的基礎，例如生物活性物質的擴散和信號的傳遞。某些疾病可能涉及細胞中粘度的正常變化。此外，由于細胞皺縮和細胞質凝縮，折皺中的細胞質粘度是細胞凋亡的重要形態學特征。由于ferroptosis在形態上與細胞凋亡不同，對于揭示鐵死亡是否伴隨細胞粘度改變具有重要意義。
   目前的熒光探針只能單獨檢測羥基自由基產生或細胞質粘滯度變化。這使得檢測過程復雜，也無法準確揭示羥基自由基與細胞質粘滯度在鐵死亡過程中的關系。因此，該課題開發了熒光探針(H-V)實現了對鐵死亡過程中羥基自由基和細胞質粘滯度的同時成像。作者利用分子轉子策略和芳環羥基化設計出探針H-V。分子轉子有兩個對稱的小π-共軛。在分子轉子中，吲哚部分是電子受體，anisole是電子供體，它們是通過可旋轉的ethylene基鍵形成D-π-A結構連接起來的。隨著微環境粘滯度的增加，分子內旋轉受到限制，從而抑制了非輻射過程中分子內扭轉電荷轉移，導致探針熒光增強。另一方面，芳環的羥基化被用來提高檢測?OH的選擇性，而強供給電子基（甲氧基）的加入能夠增強探針對?OH的捕獲能力，提高檢測靈敏度。此外，探針H-V中還引入了兩個磺酸鹽基團來中和正電荷。在H-V的donor-two-acceptors結構中，?OH造成的羥基化主要發生在甲氧基的間位上，形成Phenol intermediate，然后發生去質子化和電子重排,最終形成一個大π共軛系統(圖1)。從探針H-V到product 1光譜發生很大的紅移，并且有很鮮明的近紅外熒光變化，從而實現用獨立的通道檢測?OH，避免了粘滯度檢測通道的交叉信號。

                                          圖1. H-V對粘滯度和羥基自由基響應的機理

   在探針被合成出來之后，首先研究了探針H-V對粘滯度的響應情況。探針H-V的紫外吸收在400 nm,而在520nm處有微弱的熒光發射。然后以甲醇甘油體系模擬粘滯度，研究發現隨著粘滯度的增加，520 nm處的熒光顯著增強。在純甘油中的熒光比在純甲醇中的熒光增加了50倍。這表明探針H-V對粘滯度非常敏感。隨后，隨后研究了探針H-V對?OH的響應情況。該報道運用Fenton反應提供?OH。隨著Fenton試劑的增加，在652 nm處的熒光顯著增強，最高增強了450倍。而在其他活性氧的反應中，并沒有明顯的熒光增強。這表明探針H-V對?OH有非常高的選擇性。

                                        圖2.探針對粘滯度和羥基自由基響應的熒光變化

                                         圖3. HT-1080細胞中細胞質粘度變化的成像

H-V適用于細胞內?OH的獨立成像

                                       圖4. 探針對細胞質粘滯度和羥基自由基的獨立成像

   基于圖4結果基礎上，此文獻研究了在鐵死亡過程中，探針H-V對細胞質粘滯度和?OH的成像。通過erastin誘導細胞鐵死亡，收集兩個獨立通道的熒光信號，同時監測細胞內?OH的特異性變化和粘滯度變化。隨著erastin孵育的時間增長，紅色和綠色通道的熒光強度都增強，而使用鐵死亡抑制劑（DFO，Fer-1，Lip-1）后，熒光強度受到顯著抑制。上述結果表明，鐵死亡伴隨著胞漿粘滯度增加和?OH生成。

                                    圖5.鐵死亡中H-V對細胞質粘滯度和?OH的成像