BRG1，SWI/SNF染色質重塑復合物的ATPase亞基，是維持腸上皮細胞(IECS)內穩態以防止炎癥和腫瘤發生所必需的，是直接調控Atg16l1，Ambra1，ATG7和Wipi2轉錄的關鍵調節因子，對自噬體生物發生非常重要。BRG1缺陷型IECS的缺陷自噬導致過量的活性氧(ROS)，從而導致屏障完整性的缺陷。自噬是綜合應激反應的核心組成部分，影響許多炎癥性疾病，包括炎癥性腸病(IBD)和結直腸癌(CRC)。雖然核心機制已知，但自噬的表觀遺傳調節的分子基礎及其在結腸炎中的作用在很大程度上仍未確定。近期，一篇名為“BRG1 attenuates colonic inflammation and tumorigenesis through autophagy-dependent oxidative stress sequestration”的文章，在雜志《Nature Communications》上發表。該文章的研究重點是確定BRG1在結腸炎和結直腸腫瘤發生的小鼠模型中解決炎癥的成人功能。使用損失和獲得功能的方法，證明BRG1確保結腸內穩態和耦合自噬依賴的ROS反應。結果突出表明BRG1作為一個內穩態檢查點，抑制炎癥相關的CRC。

技術路線：

結果：
一、IBD患者上皮細胞BRG1表達降低
   BRG1減少和IBD發病機制之間存在因果關系。

圖一 IBD患者BRG1表達降低。a健康對照和IBD標本中BRG1 mRNA的盒圖(使用數據集GSE9452和GSE3365)。 b RT-qPCR分析IBD標本和健康受試者(n=81)中BRG1mRNA的表達。  c上圖顯示BRG1染色圖像，下圖顯示正常和炎癥性腸病活檢中上皮BRG1的表達(χ2檢驗)。染色指數使用10分量化標度，分數>4被認為是較高的水平。

二、成年Brg1IEC-AKO小鼠自發發展結腸炎
   為了避免BRG1丟失導致的早期發育缺陷，采用VillinCre-ERT2/+小鼠在2個月齡時通過給藥tamoxifen的方法來切除BRG1。右旋糖酐硫酸鈉（DSS）是一種誘導實驗性結腸炎的化學物質，具有IBD的臨床特征。

圖二 BRG1在成人腸道中的缺失導致結腸炎的發展。用tamoxifen治療2個月大的小鼠(Brg1flox/flox或VillinCre-ERT2；Brg1flox/flox)，從而產生Brg1F/F或Brg1IEC-AKO小鼠。a顯示了BRG1表達的免疫組織化學(上圖)和免疫印跡(IB)分析(下圖)。 b在指定的時間點顯示Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠中遠端切片的代表性組織學圖像，并顯示組織病理學的半定量評分(n=12，每個基因型)。箭頭：免疫細胞浸潤。 c從16周齡小鼠(BRG1消融后2個月)分離的結腸固有層細胞通過流式細胞術(n=4)進行分析。 d 16周齡小鼠結腸勻漿的RT-qPCR分析以評估細胞因子和趨化因子的產生(每個基因型n=6).  e來自3月齡小鼠(BRG1切除后1個月)的小腸的Alcian blue-Periodic acid Schiff(AB-PAS；杯狀細胞)染色和溶菌酶(Lys；Paneth細胞)染色以及右側顯示的定量結果 (n=5)。 f 3%DSS處理后Brg1IEC-AKO小鼠與Brg1F/F小鼠存活率比較(n=10)。  g-i小鼠飲水中添加1%DSS喂養，并記錄體重(g)和結腸長度(h)的損失(n=10)。(i)從第10天1%DSS處理的小鼠收集的中遠端結腸組織的H&E染色切片，以及在右側顯示的組織學評分定量。

三、Brg1丟失驅動炎癥相關CRC
   Brg1IEC-AKO小鼠遭受持續炎癥的觀察，促使研究BRG1在結腸炎相關腫瘤發生中的作用。因此，首先用單劑量的DNA甲基化試劑AOM治療小鼠，以確定它是否能使Brg1IEC-AKO小鼠發展腫瘤。為證實Brg1IEC-AKO小鼠中發生的慢性炎癥促進上皮異型增生，接下來通過注射AOM誘導CRC，隨后進行三個周期的1%DSS治療。在整個DSS治療期間記錄體重的變化，并在AOM治療12周后確定腫瘤負擔。

圖三 BRG1缺失促進炎癥相關的CRC。 a AOM單獨治療方案。Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠7個月齡結腸H&E染色切片的代表性圖像(每個基因型n=10)。 b RT-qPCR分析7月齡小鼠全結腸勻漿中指示基因的相對mRNA水平(每個基因型n=5)。 c Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠于第0天(2月齡)注射AOM，并按指示用1%DSS治療3個4天周期。體重變化記錄如下(n=10每基因型)。 d AOM注射12周后，處死小鼠檢測腫瘤負荷(n=10)。 e每種基因型中結腸的代表性圖像和腫瘤的總體分級(χ2檢驗)(每種基因型n=10)。 f顯示了來自20周齡AOM/1%DSS處理的Brg1F/F和Brg1IEC-AKO的腫瘤中Ki67和裂解的caspase-3染色的代表性圖像(每個基因型n=4)。

四、BRG1過表達從結腸炎和結腸炎中保護小鼠
   為確定BRG1表達的升高是否可以密切地保護小鼠免受結腸炎的侵襲，構建條件性Brg1過表達小鼠(R26BRG1/+)。為了誘導急性炎癥，我們用3%的DSS處理小鼠。

圖四 BRG1在IECS中過表達可保護小鼠免于結腸炎和腫瘤發生。a R26Brg1/+小鼠方案和BRG1在IECS(Brg1IEC-OE/+)小鼠中的條件性過表達。 b R26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠結腸組織BRG1表達的免疫組化和Western blotting分析。 c,d DSS治療5天，記錄結腸長度(C)和體重(D)(n=10)。 e 經3%DSS處理的R26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠的代表性中遠端結腸切片和組織學評分(右)(n=10)。箭頭表示免疫細胞浸潤。 f RT-qPCR分析未處理或DSS處理的小鼠(第5天，每個基因型n=4)全結腸勻漿中指示基因的相對mRNA水平。 g來自3%DSS處理的小鼠腸道的Alcian blue-Periodic acid Schiff(AB-PAS；杯狀細胞)染色和溶菌酶(Lys；Paneth細胞)染色，定量結果顯示在右側(n=5)。2月齡的小鼠接受AOM治療，隨后進行3個周期的3%DSS治療。 h AOM治療3個月后小鼠的宏觀圖像，以及基于大小的腫瘤數量在右側面板中量化(每種基因型n=10)。 i H&E染色結腸切片的代表性圖像如圖所示；右側為腫瘤的百分比分級(n=10，χ2檢驗)。

五、BRG1介導ROS穩態調節屏障完整性
   腸屏障功能障礙經常導致腸道炎癥。通過在嚴重結腸炎發病前檢查緊密連接蛋白1(ZO-1)、Claudin-1和E-cadherin的分布或表達來研究BRG1丟失是否損害了屏障完整性(3月齡小鼠檢查)。由于上皮細胞死亡是導致屏障完整性的主要因素之一，因此評估Brg1IEC-AKO小鼠中細胞存活的可能缺陷。為了解BRG1在結腸內穩態中的機制作用，使用從7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠分離的IECS進行了表達譜分析，在這個時間點BRG1缺失還沒有導致結腸炎。因此，表達改變可能反映了結腸中BRG1丟失的主要影響。為了提供更多的證據證明ROS是BRG1介導的結腸炎中的必要參與者，進行實驗以確定阻斷ROS是否可以逆轉由BRG1丟失引起的炎癥表型。為此，3月齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠在2個月齡時刪除BRG1后接受NAC治療1個月。

圖五 BRG1介導ROS反應，控制細胞凋亡和結腸炎癥。a-c樣品均來自12周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠(注射tamoxifen后1個月)。 (a) 結腸切片中具有代表性的ZO-1和E-cadherin染色。 (b) 由血清中FITC-葡聚糖濃度測定結腸通透性(n=5/基因型)。 (c) TUNEL，裂解的caspase-3和Ki67染色(n=4)。 d IECS分離自Brg1flox/flox和VillinCre-ERT2；Brg1flox/flox或5天DSS處理的R26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠，BRG1缺失通過細胞中的4-OHT處理實現。相應的命名為IECBrg1-F/F、IECBrg1F/F-CreERT2或IECBrg1/+、IECBrg1-OE/+。 e來自Brg1flox/flox和VillinCre-ERT2的有機化合物；Brg1flox/flox小鼠。培養5天后，用4-OHT處理或不用4-OHT處理，48小時后對7-AAD染色的有機物(RED)進行成像(左)。每種有機物的熒光密度的定量(右)。 f C-Casp3染色的有機切片，如所示。 g 7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠(注射tamoxifen1周后)IECS基因表達變化的GO項分析。 h 7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠8-OHdG染色。 i直方圖和MFI量化從小鼠分離的IECS中的ROS，BRG1缺失通過4-OHT處理實現(n=4每個基因型)。 j IBD標本中BRG1信號與ROS信號的相關性(Pearson‘s法)。 K-m 12周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠在BRG1缺失1個月后給予NAC處理，1個月后進行分析。結腸長度 (k), H&E (l)和RT-qPCR分析(m) ，如所示(n=5每基因型)。

六、BRG1作為IECS中的自噬檢查點
   為了闡明BRG1調節ROS的分子基礎，從2個月齡的野生型IECS中提取BRG1結合的染色質，進行免疫共沉淀并進行深度測序分析。CHIP-SEQ分析表明，12119個基因(26349個峰)在6kb的注釋基因范圍內具有BRG1占有率。為了將染色質結合與轉錄調節相關聯，chip-seq數據與表達譜對齊。一些證據表明，受損的自噬會導致氧化應激。因此，推斷BRG1通過調節自噬調節ROS穩態。為了測試這種可能性，2個月齡Brg1flox/flox和VillinCre-ERT2；Brg1flox/flox或Rosa26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠的結腸中分離出IECS。為了在全基因組范圍內區分BRG1結合位點和BRG1功能位點，在Brg1F/F和Brg1IEC-AKO IECS中進行了H3K9ac(活性基因轉錄的組蛋白標記)chip-seq。

圖六 BRG1調節IECS中的自噬以控制ROS和結腸炎癥。從Brg1flox/flox，VillinCre-ERT2；Brg1flox/flox或R26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠中分離IECS，并且通過細胞中的4-OHT處理來實現BRG1缺失(以下稱為IECBrg1-F/F，IECBrg1-F/F-CreERT2或IECBrg1/+，IECBrg1-OE/+)。a顯示BRG1結合基因的數量并顯示BRG1-KO IECS表達變化的Venn圖(BRG1消融的1周)。右圖顯示了重疊基因的GO術語分析。 b heatmap總結了與自噬調節相關的基因表達的RNA-seq結果。 c免疫印跡顯示LC3轉換和p62水平。 d透射電鏡檢測自噬小體，并對7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠(BRG1缺失1周；每個基因型n=5)的結腸進行定量。箭頭表示自噬小體，M：線粒體。 e 7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠結腸LC3-GFP染色。 F,g  LC3-GFP染色(f)和IECBrg1F/F-CreERT2經4-OHT處理的指示蛋白的IB分析，如圖(g)所示。 h,i 加或不加氯喹(CQ 10μM)處理的IECBrg1-F/F和IEC-CreERT2中的IB分析(h)和LC3-GFP染色(i)。 j Venn圖顯示與BRG1，H3K9ac結合的重疊基因，并顯示BRG1-KO IECS中的表達變化。 k RT-qPCR分析IECS中指示的基因(BRG1KO或過表達)，并通過熱圖(n=3)總結結果。 l 從野生型小鼠分離的IECS中Atg16l1，Wipi2，ATG7和Ambra1基因位點的BRG1 chip-Seq信號的快照。 m 芯片-qPCR分析IECS中Atg16l1，Wipi2，ATG7和Ambra1基因位點的BRG1結合和H3K9ac編碼，如所示(n=5，每個基因型)。箭頭指示芯片-qPCR引物對的位置。

七、BRG1調節自噬以控制IECS中的ROS反應
   鑒于ATG16L1在自噬小體形成和結腸炎中的功能和臨床重要性，評估在BRG1缺失的IECS中Atg16L1的下調是否確實導致了失控的ROS反應和細胞存活缺陷。因此，使用寡核苷酸在IECBrg1-F/F和IECBrg1-F/F；CreERT2中敲除(KD)Atg16l1。除了Atg1611外，BRG1直接調節Wipi2，ATG7和Ambra1，它們對自噬小體生物發生也很重要。為了進一步闡明結腸炎癥中brg1和自噬之間的功能依賴性，產生了有條件地消融切除IECs 中自噬蛋白ATG5的VillinCre/+；Atg5flox/flox小鼠(Atg5IEC?/?).腸道微生物區系在疾病發展和進展過程中起著驅動炎癥反應的重要作用。為了排除腸道微生物群參與BRG1缺乏引起的腸道屏障損害的可能性，通過用含有抗生素雞尾酒的飲用水治療Brg1IEC-AKO和Brg1F/F小鼠3周，然后用1%的DSS治療，產生了腸道微生物區系枯竭小鼠。通過16S rDNA測序證實腸道微生物區系耗盡。

圖七 BRG1保護結腸炎癥依賴于自噬的調節。a IECBrg1-F/F(對照)或IECBrg1-F/F-CreERT2(BRG1 KO)中指示蛋白的IB分析，帶有或不帶有ATG16L1敲除或恢復。 b 如圖所示，IECS中ROS水平的量化(每個基因型n=4)。 c 從小鼠分離的IECS中BRG1，ATG5和LC3的免疫印跡分析。 d-h在飲水中給藥DSS5天。結腸長度(d)和體重(e)記錄在IECS中具有或不具有ATG5缺失的R26Brg1+和Brg1IEC-OE/+小鼠中(n=8)。 f DSS治療9天后，來自所指示的小鼠基因型的結腸切片的組織學。 g RT-qPCR分析DSS處理小鼠結腸勻漿中相對mRNA表達水平(第9天；每個基因型n=5)。 h如所示，量化小鼠IECS中的ROS水平(每基因型n=4)。 i BRG1直接控制IECS中Atg16l1，Wipi2，ATG7和Ambra1等多層面自噬成分基因。因此，成年BRG1在IEC中的丟失導致自噬不足，導致過量的活性氧(ROS)，從而損害屏障完整性并促進炎癥。代償性再生加上ROS誘導的DNA損傷促進了CRC的惡性進展。