環(huán)狀RNA(circRNA)在腫瘤進展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。circRNA通常通過作為miRNA海綿調(diào)節(jié)基因表達,但circRNA編碼的肽段在腫瘤作用仍不明確。近期,來自蘇州大學(xué)的研究團隊在Molecular Cancer期刊上發(fā)表題名為A novel protein encoded by a circular RNA circPPP1R12A promotes tumor pathogenesis and metastasis of colon cancer via Hippo-YAP signaling的文章。該文章揭示了結(jié)腸癌(CC)進程中circRNA circPPP1R12A的編碼肽段的作用,circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路促進了CC的腫瘤發(fā)病和轉(zhuǎn)移。
1、CC組織和細(xì)胞中circRNA的表達譜和篩選
使用circRNA基因芯片確定10例結(jié)腸癌患者癌和癌旁組織circRNA表達譜。在CC與癌旁組織間共有126個差異表達的circRNA;與癌旁組織相比,在CC組織中有110個circRNA上調(diào),有16個circRNA下調(diào)。這些circRNAs大多位于外顯子區(qū)域。hsa_circ_0000423(circPPP1R12A)在CC組織中上調(diào)最為明顯,由位于12q21.2 PPP1R12A基因24、25外顯子反向拼接而成。接下來通過qRT-PCR檢測20例CC患者癌和癌旁組織中circPPP1R12A表達,確定其表達升高。與正常人結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞系NCM460細(xì)胞相比,circPPP1R12A表達在CC細(xì)胞系(HT-29,HCT-116,SW480,SW620,LoVo,SW48,DLD-1,Caco2和HCT-15)中明顯上調(diào)。
2、CC細(xì)胞和組織中circPPP1R12A的存在和亞細(xì)胞分布的特征
實驗根據(jù)circPPP1R12A特征設(shè)計了兩組引物。一組(divergent primers,發(fā)散引物)用于擴增環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物,而另一組(convergent primers,收斂引物)用于檢測線性轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果表明,收斂引物可以用于cDNA和gDNA擴增,而發(fā)散引物只能用于cDNA擴增。為了進一步證實circPPP1R12A的存在,使用RNase R降解試驗評估circPPP1R12A對RNase R處理的抗性。結(jié)果顯示,通過RNase R處理降解了PPP1R12A的線性轉(zhuǎn)錄物,而這種處理未能降解circPPP1R12A的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物。核質(zhì)量分離測定法和FISH分析結(jié)果顯示93%以上的circPPP1R12A出現(xiàn)在HCT-116和LoVo細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。還通過原位雜交技術(shù)檢測100例CC患者癌和癌旁組織中circPPP1R12A的表達。結(jié)果表明circPPP1R12A在CC組織中的表達高于正常組織,并且這種表達上調(diào)與更高的TNM分期呈正相關(guān)。并且生存曲線表明,circPPP1R12A表達較高的患者的總生存期較短。
3、circPPP1R12A促進細(xì)胞增殖 在兩個低circPPP1R12A表達的CC細(xì)胞系(DLD-1和Caco-2)中通過質(zhì)粒過表達了circPPP1R12A,并通過PCR驗證過表達效率。CCK8和集落形成的結(jié)果表明,circPPP1R12A過表達加速了DLD-1和Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞增殖。劃痕實驗和Transwell結(jié)果表明,過表達circPPP1R12A也增強DLD-1和Caco-2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外,在兩個高表達circPPP1R12A的CC細(xì)胞系(HCT-116和LoVo)中通過質(zhì)粒過表達了circPPP1R12A。通過CCK8和集落形成結(jié)果證明,circPPP1R12A過表達加速了HCT-116和LoVo細(xì)胞的細(xì)胞增殖。但是,circPPP1R12A過表達未能在劃痕實驗和Transwell中顯示對CC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
4、敲低circPPP1R12A可抑制CC細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲能力
接下來,研究敲低circPPP1R12A對細(xì)胞增殖,遷移和侵襲性的影響。通過PCR證驗證敲低效率,circPPP1R12A的敲低影響了兩個高表達細(xì)胞系的增殖(圖和集落形成的能力。在劃痕和Transwell測定中,circPPP1R12A的敲低顯著影響HCT-116和LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些結(jié)果表明,circPPP1R12A在CC細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
5、CircRNA circPPP1R12A編碼一個小的未鑒定蛋白
circRNA circPPP1R12A最初是在circRNA Db數(shù)據(jù)庫中標(biāo)注的,因此發(fā)現(xiàn)circPPP1R12A具有一個短的216 nt的小ORF,具有編碼73個氨基酸肽段的潛力。在人類circPPP1R12A中,環(huán)化產(chǎn)生了起始密碼子AUG,該起始密碼子與遺傳密碼一起開始翻譯。circPPP1R12A的ORF應(yīng)該被翻譯成73個氨基酸的蛋白,稱之為circPPP1R12A-73aa。設(shè)計標(biāo)記的過表達載體(Lv-flag-circPPP1R12A),突變一個位點的載體(Lv-flag-circPPP1R12A-Mut)和過表達circPPP1R12A-73aa mRNA的載體。PCR驗證DLD-1和Caco-2細(xì)胞過表達效率,WB檢測DLD-1和Caco-2細(xì)胞circPPP1R12A-73aa蛋白表達情況。通過LC-MS / MS從證實circPPP1R12A翻譯了circPPP1R12A-73aa,并確定了circPPP1R12A-73aa的獨特的氨基酸序列。在LC-MS / MS結(jié)果中,從10 kDa條帶中鑒定出超過76%的circPPP1R12A-73aa序列。另外,鑒定了由circPPP1R12A翻譯獨特的氨基酸序列為“ GRLRHVNCLSPGVQD”。
6、CircPPP1R12A-73aa在體外和體內(nèi)促進CC的增殖和轉(zhuǎn)移能力
為了進一步探索circPPP1R12A-73aa的生物學(xué)功能,在低表達CC細(xì)胞系DLD-1和Caco-2中穩(wěn)轉(zhuǎn)上述過表達載體。CCK8、集落形成實驗和細(xì)胞周期結(jié)果證實過表達circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa增加的細(xì)胞增殖能力。然而突變的circPPP1R12A的過表達組中,不能翻譯circPPP1R12A-73aa,不能增加DLD-1和Caco-2細(xì)胞的增殖能力。劃痕實驗和Transwell結(jié)果中,過表達circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa增強了遷移和侵襲的能力,突變體circPPP1R12A的過表達未能提高這些能力。這些數(shù)據(jù)表明,如果沒有circPPP1R12A編碼蛋白circPPP1R12A-73aa參與,circPPP1R12A并不能直接調(diào)控CC細(xì)胞的增殖。接下來,利用異種移植腫瘤模型進一步研究了circPPP1R12A-73aa在體內(nèi)CC細(xì)胞生長中的作用。過表達circPPP1R12A和circPPP1R12A-73aa組中腫瘤體積和重量明顯大于載體對照組和突變組。并且在小鼠生物發(fā)光成像結(jié)果中,突變組的腫瘤肝轉(zhuǎn)移顯著減少。這些數(shù)據(jù)表明, 是circPPP1R12A編碼的circPPP1R12A-73aa促進了CC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,而不是circPPP1R12A。
7、circPPP1R12A-73aa通過激活hippo-YAP信號通路促進CC的增殖,遷移和侵襲能力
對四組穩(wěn)轉(zhuǎn)DLD-1細(xì)胞進行RNA測序分析,篩選出差異表RNA,以確定可能的信號通路。通過KEGG通路分析,篩選出差異信號通路。Hippo-YAP作為最豐富的信號通路接受下一步WB驗證。YAP1是Hippo信號通路中的轉(zhuǎn)錄共激活子,而YAP1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要。為了驗證YAP1激活是否為癌細(xì)胞的circPPP1R12A-73aa誘導(dǎo)的生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵,在過表達circPPP1R12A-73aa的DLD-1和Caco-2 DLD-1和Caco-2和Caco-2細(xì)胞系中加入YAP1抑制劑肽17,實驗結(jié)果肽17顯著抑制了因circPPP1R12A-73aa過表達引起的CC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力增強。
結(jié)論:
CC組織和細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了circRNA circPPP1R12A高表達。circPPP1R12A編碼的circPPP1R12A-73aa促進了CC細(xì)胞在體內(nèi)與體外增殖和轉(zhuǎn)移,而不是circPPP1R12A。circPPP1R12A-73aa通過激活Hippo-YAP信號通路提高了CC細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲能力。