美國杜克大學醫學院的Kate D. Meyer取得一項新進展。研究人員開發了一個名為DART-seq的技術，該方法能夠不使用抗體來對全局的m6A修飾進行檢測。相關論文“DART-seq: an antibody-free method for global m6A detection” 于2019年9月23日在線發表于《自然—方法學》, IF= 28.467。
   原理：在DART-seq中，胞苷脫氨酶APOBEC1與m6A結合的YTH結構域融合。細胞中APOBEC1-YTH的表達可在與m6A殘基相鄰的位點誘導C-U脫氨，可使用標準RNA序列檢測到。 DART-seq可從低至10ng的總RNA中識別出細胞中的數千個m6A位點，并可隨時間檢測細胞中m6A的積累。此外，研究人員使用長讀本的DART-seq來深入研究了m6A沿單個轉錄本長度的分布。
   研究人員表示，改變甲基化位點附近序列的策略將能夠通過標準RNA-seq檢測m6A，從而克服了當前方法的主要局限性，APOBEC1是一種胞嘧啶脫氨酶，其靶向DNA和RNA以誘導胞嘧啶-尿嘧啶（C-to-U）編輯。盡管最初發現它具有編輯ApoB mRNA的能力，但是APOBEC1自此被用于基于CRISPR–Cas9的基因組編輯方法中，以在目標單鏈DNA位點誘導C-U轉換。我們推測，可以通過將APOBEC1與m6A結合的YTH域融合并用RNA-seq檢測隨后的編輯事件，采用類似的策略來編輯RNA中的m6A鄰近胞苷。在這里，我們展示了這種方法的實用性，可使用轉錄組范圍的作圖法以低至10ng的總RNA作為輸入來檢測細胞RNA中的m6A位點。我們的策略綜述了基于抗體的甲基化RNA檢測方法，并提供了對單個轉錄亞型中m6A殘基聚類的見解。這種方法大大改善了與全局m6A檢測相關的時間和成本，并將能夠在有限的RNA樣品中進行轉錄組范圍的作圖。
一、制定有針對性的脫氨策略以檢測m6A

   開發用于m6A檢測的無抗體方法。m6A的首先選用共有序列包含緊接m6A位點的恒定胞苷殘基（Rm6ACH，其中R = A或G； H = A，C或U），作者推測將APOBEC1募集到m6A位點將使m6A殘基緊接著的胞苷脫氨。為了測試這一點，我們將APOBEC1與YTHDF2的m6A結合YTH域融合。然后將APOBEC1-YTH融合蛋白與含有單個內部腺苷的合成RNA孵育。反轉錄和Sanger測序表明在甲基化RNA中緊接m6A后立即對胞苷進行頻繁編輯，而在未甲基化RNA中則不是如此（補充圖1a）。APOBEC1與YTH域融合，以指導在m6A位點附近的胞苷殘基上進行C-to-U編輯。DART-seq方法的示意圖。APOBEC1-YTH在細胞中表達，分離出總RNA并進行RNA測序。然后檢測到C到U突變以鑒定m6A的位點。

二、DART-seq可識別整個轉錄組中包含m6A的RNA

A:餅狀圖，顯示了表達 APOBEC1-YTH（左）和 APOBEC1-YTHmut（右）的細胞中不同轉錄本區域中 C-U 編輯位點的分布（每個 n = 3 個獨立樣本）。B: Metagene 分析顯示了 DART-seq 檢測到的 C 到 U 編輯事件分布的密度圖。結果代表三個獨立實驗。C:在表達 APOBEC1-YTH（n = 39,069）， APOBEC1-YTHmut（n = 21,841）或單獨 APOBEC1 的細胞中，在 C-U 編輯位點周圍的± 4-nt 區域內發現的最豐富的基序（ n = 6,814）。使用累積二項式分布來計算單個基序富集的 P 值。 D: DART-seq 數據的整合基因組學查看器（IGV）瀏覽器跟蹤，這些數據在 JUN 和 EEF2 mRNA 中表達所示的構建體。在至少 10％的讀數中發現的 C 到 U 突變由金色/綠色表示（金色表示 C 位點的豐度，綠色表示每個位置的 U 位點的豐度；兩個基因均從負鏈轉錄） 。由 MeRIP-seq（藍色軌道）標識的 m6A。結果代表三個獨立實驗。 E:在 ACTB 位點的 DART-seq 讀取覆蓋率。在至少 10％的讀數中發現 C 到 U 突變由單個位點的金色/綠色表示（金黃色表示 C 位點的豐度，綠色表示每個位置的 U 位點的豐度； ACTB 指從陰性位置轉錄）。

三、DART-seq監測 m6A 隨時間的變化情況

A:與未經處理的對照（UT； n = 40,594）相比， DART-seq 在經 CPT 處理的 HEK293T 細胞（n =5,689）中發現的 C 至 U 突變的分布。 ** P <0.0001。 B-C: IGV 瀏覽器圖像顯示了 CPT 處理后 BPTF（b）和 ATRX（c）轉錄本的 CDS 中的C 到 U 突變。在至少 10％的讀數中發現的 C 到 U 突變由藍色/紅色（C / U）著色表示BPTF 轉錄本（正鏈），以及 ATRX 轉錄本（負鏈）中的金/綠（C / U）著色。 CPT 處理后富集的 C-U 站點由紫色三角形表示。 n = 2 個獨立樣本。D: MeRIP-RT-qPCR 證實了 CPT 處理后 BPTF 和 ATRX mRNA 中 m6A 的富集。E: 使用未經處理和經 CPT 處理的細胞中的 RNA 進行的 RT–qPCR 分析顯示，經過 CPT 處理后， BPTF 和 ATRX 轉錄本的豐度降低。

四、長時間閱讀的 DART-seq 顯示了單個 RNA 分子中的 m6A 分布

   長時間閱讀的 DART-seq 顯示了同工型特異性甲基化模式。基于免疫沉淀的 m6A 檢測策略先前已報告了 m6A 位點的聚類 3–5.但是，尚不清楚這是否反映了 m6A 在相同或不同的 RNA 分子上的聚集。由于 DART-seq 誘導單個轉錄本中的編輯事件，因此我們認為可以檢查單個測序讀數以確定在同一 RNA 分子中是否存在 m6A 位點。為了對此進行調查，我們使用 PacBio 平臺進行了長時間讀取的 DART-seq。單個 mRNA 的檢測表明，盡管某些轉錄本表現出同工型特異性區域編輯，但其他轉錄本在5'UTR， CDS 和 3'UTR 中包含 DART-seq 位點。此外，有 41％的讀取至少跨越兩次。