長非編碼RNA在多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的生物學(xué)作用和治療潛力是一個尚需研究的問題。針對NEAT1沉默的研究可以為抗MM的治療方法提供新的思路。 近日,一篇名為“Long non-coding RNA NEAT1 targeting impairs the DNA repair machinery and triggers anti-tumor activity in multiple myeloma”的研究向我們展示了最新的研究結(jié)果。
技術(shù)路線:
與正常骨髓漿細(xì)胞相比,NEAT1在MM和PCL患者中過表達(dá)。將NEAT1表達(dá)分析擴(kuò)展到具有代表性的廣泛的人類血液腫瘤,包括MM(n=20),淋巴瘤(n=8)和白血病(n=7)細(xì)胞系。按照之前描述的基于定量實時PCR的方法,發(fā)現(xiàn)在人骨髓瘤細(xì)胞系(HMCL)中NEAT1的全局表達(dá)比在其他腫瘤細(xì)胞系中高出約六倍(圖1)。
據(jù)報道,g#N1可以使NEAT1沉默。研究者使用亞細(xì)胞毒性濃度(5μM)評估g#N1_E傳遞的時間依賴性效應(yīng)。如圖2a所示,NCI-H929和AMO-1細(xì)胞系中g#N1_E傳遞顯著下調(diào)了兩種NEAT1亞型的表達(dá),導(dǎo)致lncRNAs沉默4天后細(xì)胞活力降低(圖2b,c)。基于BM對MM腫瘤細(xì)胞的支持作用,接下來在BM環(huán)境下測試了NEAT1的沉默。如圖2d所示,g#N1_E處理也抑制了NCI-H929和AMO-1細(xì)胞系與HS-5細(xì)胞共培養(yǎng)時的生長和生存。這些數(shù)據(jù)表明,NEAT1靶向可能能夠克服BM環(huán)境對MM細(xì)胞的增殖和促進(jìn)生存的影響。體內(nèi)實驗證實,通過使用從g#N1_E的體外活性衍生的治療計劃,并基于為類似的LNA ASO設(shè)計的方案,可以發(fā)現(xiàn)g#N1_E減少了AMO-1異種移植物的生長(圖2e)。最后,評估裸露的g#N1_E對來自MM患者的CD138+細(xì)胞的抗MM作用。在g#N1_E暴露6天后,NEAT1下調(diào)導(dǎo)致明顯的細(xì)胞死亡,證實了對HMCL的影響(圖2f)。
對NEAT1耗盡的MM細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析。如圖3a所示,在NEAT1敲除6天后,測量到細(xì)胞周期相位分布的強(qiáng)烈調(diào)整。此外,細(xì)胞熒光分析也顯示在兩種細(xì)胞系中S期減少,這進(jìn)一步證實了BrdU攝取減少(圖3b)。在NEAT1沉默5天后,通過流式細(xì)胞術(shù)、western blot分析和caspase-3和-7活性測定分析NEAT1對細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,與相對陰性對照相比,AMO-1,NCI-H929,沉默細(xì)胞的凋亡率顯著增加(圖3c)。WB法測定caspase 3和7裂解,結(jié)果顯示在NEAT1沉默后PARP裂解(圖3d)。在體內(nèi)也觀察到了減少的增殖和凋亡特征,NEAT1KD既增加了caspase-3,又減少了AMO-1異種移植細(xì)胞的Ki67染色(圖3e)。NEAT1耗盡也在MM患者衍生的腫瘤中觸發(fā)caspase3和7切裂解(圖3f)。
為了確定MM中NEAT1下游相關(guān)通路,對NEAT1耗竭后NCI-H929和AMO-1的基因表達(dá)譜分析。在用g#N1_E LNA-gapmeR處理96小時的不同HMCL和其他血液腫瘤中,通過qRT-PCR驗證了五個基因的調(diào)節(jié)。只有表現(xiàn)出生物學(xué)反應(yīng)的細(xì)胞系(就降低的活性而言)在g#N1_E LNA-gapmeR給藥后也表現(xiàn)出這些基因的下調(diào)(圖4a)。對從AMO-1小鼠移植瘤細(xì)胞中提取的RNA進(jìn)行的qRT-PCR分析證實,在g#N1_E LNA-gapmeR給藥后,這些基因下調(diào),用g#N1_E LNAgapmeR處理48小時的原代腫瘤細(xì)胞分析也證實了這些發(fā)現(xiàn)(圖4b)。。
聚焦于這些途徑,可以發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白隨著激酶蛋白CHK1和Chk2的磷酸化部分的降低而減少,這些蛋白都參與了DNA損傷檢查點;發(fā)現(xiàn)RPA32和BRCA1的活性量下調(diào),這兩種蛋白分別是DNAdamage傳感器蛋白和DNA修復(fù)機(jī)制的必要效應(yīng)器(圖5a)。
為了評估NEAT1沉默引起的DNA修復(fù)過程的假設(shè)損傷是否與DNA損傷增加相關(guān),評估當(dāng)DNA損傷發(fā)生時被磷酸化的H2A.X蛋白的表達(dá)和模式分布。如圖5b的WB所示,NEAT1下調(diào)導(dǎo)致遺傳毒性應(yīng)激增加。接下來研究了Oaparib(一種PARP抑制劑,在HR缺乏的腫瘤中誘導(dǎo)合成致死性)在NEAT1耗竭細(xì)胞中的作用。在NEAT1存在或不存在的情況下增加了這種藥物的濃度,處理了AMO-1和NCI-H929,然后評估每個樣品中的細(xì)胞存活,g#N1_E LNA-gapmeR與olaparib的組合在幾乎所有的測試組合中都產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)(圖5c)。
為了評估NEAT1在MM細(xì)胞耐藥機(jī)制中的作用,評估與MM治療的最常用藥物,即Bortezomib,Carfilzomib和Melphalan的協(xié)同效應(yīng)的發(fā)生情況。為此,用存在或不存在NEAT1 gapmeR的不同濃度的每種藥物處理NCI-H929和AMO-1細(xì)胞系,然后評估每個樣品中的活細(xì)胞。結(jié)果,g#N1_E LNA-gapmeR與carfilzomib、melphalan或bortezomib的組合產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)(圖6a)。
為了深入了解NEAT1抑制與卡非羅米和硼替佐米聯(lián)合使用的協(xié)同作用,將蛋白酶體抑制劑通過靶向ssDNA/RPA32信號中間體來破壞同源DNA重組。基于g#N1_E LNA-gapmeR誘導(dǎo)的RPA32活性量的下調(diào)(圖5a),評估了結(jié)合蛋白酶體抑制劑和NEAT1反義寡核苷酸對pRPA32的影響。如圖6b,與各單獨(dú)處理相比,卡非唑米和硼替佐米聯(lián)合NEAT1抑制進(jìn)一步降低了pRPA32在NCI-H929和AMO-1中的比例。