2019年6月發表在Immunity 的一篇文章，論文名字為”Inflammasome Activation Triggers Blood Clotting and Host Death through Pyroptosis“(影響因子： 21.522)。該論文主要研究了兩條促凝血通路，簡來說：炎性體的過度激活導致凝血，從而引發了宿主死亡。主要思路如下圖：

  首先，我們先來了解一下細胞焦亡的概念，細胞焦亡與細胞凋亡、細胞自噬、細胞壞死的區別：細胞焦亡(Pyroptosis)是一種最新發現的炎癥細胞程序性死亡方式，主要通過炎癥小體介導包含Caspase-1在內的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內的多種Gasdermin家族成員發生剪切和多聚化，造成細胞穿孔，進而引起細胞死亡。相比于細胞凋亡(apoptosis)，細胞焦亡發生的更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。
細胞發生焦亡時，細胞會發生腫脹，在細胞破裂之前，細胞上形成凸出物，之后細胞膜上形成孔隙，使細胞膜失去完整性，釋放內容物，引起炎癥反應，此時，細胞核位于細胞中央，隨著形態學的改變，細胞核固縮，DNA斷裂。
  本文研究的細胞焦亡的途徑主要有兩種，我們通過促凝血中的每一個關鍵點，分別用小鼠基因缺失型來驗證每個關鍵點的重要性，從而證明整個促凝血通路的作用機制。

技術路線：

結果:
一、細菌桿狀蛋白EprJ激活炎癥小體導致全身性凝血

圖1.體內EprJ的給藥引起系統性凝血(A–E) 給小鼠(C57BL/6J)靜脈注射PBS(Ctrl)或EprJ(每只小鼠300 ng LFn-EprJ加3 mg PA)。PBS或EprJ注射90min后收集血液。測量凝血酶原時間(A)，血漿纖維蛋白原濃度(B)，血漿TAT濃度(C)，EprJ注射前后的總血小板計數(D)和血漿微泡(MVs)(E)中的TF活性。實心圓圈代表個別小鼠；橫線代表組均值。
二、桿狀蛋白誘導的凝血激活需要Caspase-1
  炎性小體在Caspase-1缺陷小鼠EprJ誘導的凝血中的作用。EprJ引起的凝血依賴于caspase-1，caspase-1是炎性體活性的關鍵蛋白酶。

圖2. Cprase-1是EprJ誘導的血液凝固和致命性所必需的A.向C57BL/6J小鼠(野生型[WT])或Casp1/11^-/-小鼠靜脈注射從C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J小鼠(GFP)和用Alexa Fluor 568標記的(紅色)抗纖維蛋白單克隆抗體(59D8)，然后靜脈注射EprJ。使用活體顯微鏡檢查提睪血管中的血栓形成。 EprJ注射后15min和60min，在同一位置獲取圖像。B.用EprJ靜脈注射C57BL/6J小鼠(WT)或Casp1/11^-/-小鼠。90min后，對小鼠實施euthanasia并用PBS灌注，然后在生理壓力下用10％福爾馬林固定灌注45min。用抗血纖蛋白單克隆抗體(59D8)對肝切片進行免疫染色。野生型小鼠的肝臟中顯示纖維蛋白沉積(箭頭)。C.用EprJ靜脈注射C57BL/6J小鼠(WT)或Casp1/11^-/-小鼠。 90min后，對小鼠實施euthanasia，并分離組織。用抗纖維蛋白單克隆抗體(59D8)通過免疫印跡檢測組織裂解物中的纖維蛋白。(D–F) 將C57BL/6J小鼠(WT)，Casp1/11^-/-小鼠，Casp11缺陷小鼠和TLR4缺陷小鼠靜脈注射PBS或EprJ。PBS或EprJ注射90min后收集血液。測量凝血酶原時間(D)，血漿纖維蛋白原濃度(E)和血漿TAT濃度(F)。G.給C57BL/6J小鼠(WT)或Casp1/11^-/-小鼠靜脈注射致死劑量的EprJ。顯示了用EprJ攻擊的小鼠的Kaplan-Meier生存圖。

三、炎癥激活通過細胞焦亡促進凝血和致死性
   caspase-1裂解GSDMD并觸發細胞凋亡，這是一種程序性細胞死亡形式，具有與壞死相似的形態。我們使用Gsdmd^-/-小鼠檢驗了GSDMD依賴性細胞焦亡會驅動炎癥引起某些凝血和致死性的假說，結果發現GSDMD缺乏小鼠阻止了大腸桿菌感染誘導的凝血系統性激活。

圖3. GSDMD依賴的細胞凋亡對于炎性體驅動的凝血和致命性至關重要A.EprJ靜脈注射C57BL/6J(WT)或GSDMD^-/-小鼠。 90min后，對小鼠實施euthanasia，并分離組織。用抗纖維蛋白單克隆抗體(59D8)通過免疫印跡檢測組織裂解物中的纖維蛋白。B.D C57BL/6J小鼠(WT)或GSDMD^-/-小鼠靜脈注射PBS(Ctrl)或EprJ。PBS或EprJ注射90min后收集血液。測量凝血酶原時間，血漿纖維蛋白原濃度(C)和血漿TAT濃度(D)。(E和F) 向C57BL/6J小鼠(WT)或GSDMD^-/-小鼠靜脈注射PBS(Ctrl)或BsaK或PrgJ。注射后90min收集血液。測量凝血酶原時間(E)和血漿TAT濃度(F)。(G和H) 給C57BL/6J小鼠(WT)或GSDMD^-/-小鼠靜脈注射致死劑量的EprJ(G)或BsaK(H)。顯示了用EprJ攻擊的小鼠的Kaplan-Meier生存圖。

四、單核細胞和巨噬細胞是炎性體激活誘導的凝血和致死性的主要貢獻者
  單核細胞和巨噬細胞在炎癥小體檢測細菌感染中至關重要。為了確定單核細胞和巨噬細胞對EprJ誘導的凝血的貢獻，我們使用Clodronic Acid鹽脂質體的給藥在24h內使血液單核細胞減少了90％。通過PT，血漿纖維蛋白原和TAT濃度的測量，單核細胞和巨噬細胞的預耗盡顯著減弱了EprJ誘導的凝血(圖4A-4C)，支持了單核細胞和/或巨噬細胞在EprJ誘導的凝血中的核心作用，提高了用致死劑量的EprJ攻擊的小鼠的存活率，從而確定了它們在炎性體誘導的致死性中的重要性(圖4D)。

五、炎性體激活后，凝血激活需要巨噬細胞衍生的TF。
  單核細胞和巨噬細胞是體內TF的主要來源。巨噬細胞可在體外通過ATP激活caspase-1時釋放TF陽性MV。從巨噬細胞釋放TF需要caspase-1依賴性炎癥小體活性。表明炎癥小體激活可能是人類和嚙齒類動物中凝血起始的保守機制。甘氨酸緩沖阻止了TF從野生型細胞中釋放(圖4G)，表明TF不是通過GSDMD形成的孔釋放，而是TF釋放需要細胞膜破裂。

圖4.巨噬細胞凋亡通過促進TF陽性小囊泡的釋放在炎性體誘導的凝血中起關鍵作用(A–C) 在靜脈注射PBS(Ctrl)或EprJ之前24h，將C57BL/6J小鼠靜脈注射對照脂質體(Lipo)或含Clodronic Acid的脂質體(Cldn)。PBS或EprJ注射90min后收集血液。測凝血酶原時間(A)，血漿纖維蛋白原濃度(B)和血漿TAT濃度(C)。C.在靜脈內注射致死劑量的EprJ之前24h，向C57BL/6J小鼠靜脈內注射對照脂質體(Lipo)或含Clodronic Acid的脂質體(Cldn)。注：Cldn可以消耗單核細胞和巨噬細胞。D. 將C57BL/6J(WT)，Casp1/11^-/-，Casp11^-/-小鼠和TLR4^-/-小鼠的BMDM與各種T3SS桿狀蛋白(100 ng/mL LFn-桿狀蛋白加1 mg / mL PA孵育)45min。通過熒光免疫印跡檢測上清液中的TF和p20 caspase-1。在免疫印跡之前，將細胞培養上清液沉淀以濃縮蛋白質。E.將來自C57BL/6J(WT)和TLR4^-/-小鼠的BMDM與各種T3SS桿狀蛋白溫育45min。通過熒光免疫印跡檢測上清液中的TF和p20 caspase-1。F.將來自C57BL/6J(WT)和GSDMD^-/-小鼠的BMDM與EprJ孵育45min。通過熒光免疫印跡檢測上清液中的TF和p20 caspase-1。甘氨酸(+)表示添加5 mM甘氨酸作為滲透保護劑，以防止與細胞焦亡相關的膜破裂。G. 將THP-1細胞與T3SS桿狀蛋白EprI(1mg/mL LFn-EprI加1mg/mL PA)孵育45min。在免疫印跡分析之前，將細胞培養上清液沉淀以濃縮蛋白質。H.將THP-1與EprI一起溫育45min。從上清液中分離出MV，并測量TF活性。(J)血漿MV TF活性。向C57BL/6J(WT)，Casp1/11^-/-和GSDMD^-/-的小鼠靜脈注射EprJ。EprJ注射后90min收集血液。從血液中分離出MV，并測量TF活性。

六、組織因子對炎性體致死率負責
  GSDMD-依賴的細胞凋亡促進了TF陽性MV的釋放，釋放到血漿中的MV TF主要來自焦單核細胞和巨噬細胞。TF可能通過誘導凝血而導致炎性體激活誘導的死亡。

圖5.組織因子抑制作用可防止炎性體誘導的凝血和致命性(A–B) TF的藥理抑制作用。給C57BL/6J小鼠靜脈注射大鼠IgG或大鼠抗小鼠TF中和抗體1H1(8 mg/kg)。 2h后，給小鼠靜脈內注射EprJ。 EprJ注射后90min收集血液。測量凝血酶原時間(A)和血漿TAT濃度(B)。C.給C57BL/6J小鼠靜脈注射大鼠IgG或1H1(8 mg/kg)。2h后，給小鼠靜脈注射致死劑量的EprJ。(D–F) 通過將B6.Cg-Tg(UBC cre/ERT2)1Ejb/J Cre轉基因小鼠與TF浮選小鼠雜交產生了可誘導的TF缺陷小鼠。 TF缺陷型小鼠或野生型同窩動物靜脈注射EprJ。 EprJ注射后90min收集血液。測量凝血酶原時間(D)和血漿TAT濃度(E)。F.TF致死小鼠或野生型同窩小鼠注射致死劑量的EprJ。

七、LPS通過非典型的炎性體途徑誘導凝血。
革蘭氏陰性細菌通過多種機制激活炎癥小體。LPS通過依賴于炎癥小體的TF釋放觸發凝血。因為LPS通過炎癥小體激活引起凝結，所以我們假設GSDMD依賴性細胞焦亡也通過Gsdmd ^-/-小鼠驅動LPS誘導的非典型凝結和致死性。 GSDMD缺乏癥對LPS誘導的血細胞減少癥表現出適度但重要的保護作用(圖6I)。
   

圖6. LPS激活非規范性炎癥小體會觸發血液凝結(A–D) 將C57BL/6J小鼠(WT)，Casp11^-/-和TLR4^-/-小鼠腹膜內注射4 mg/kg Poly(I:C)進行初免。 8h后，給小鼠腹膜內注射PBS(Ctrl)或50mg / kg LPS。注射PBS或LPS后4h收集血液。測量LPS注射前后的凝血酶原時間(A)，血漿纖維蛋白原濃度(B)，血漿TAT濃度(C)和總血小板計數(D)。E.將來自C57BL/6J(WT)，Casp11^-/-，TLR4^-/-和GSDMD^-/-小鼠的BMDM與Poly(I:C)(1 mg/mL)孵育。5h后將細胞用PBS(Ctrl)或LPS(2mg / mL)轉染。在免疫印跡之前，將細胞培養上清液沉淀以濃縮蛋白質。(F-I) 將C57BL/6J小鼠(WT)或GSDMD^-/-小鼠腹膜內注射4 mg/kg Poly(I:C)進行引發。8h后，給小鼠腹膜內注射PBS(Ctrl)或50mg/kg LPS。注射PBS或LPS后4h收集血液。測量LPS注射前后的凝血酶原時間(F)，血漿纖維蛋白原濃度(G)，血漿TAT濃度(H)和總血小板計數(I)。(J) 在腹膜內注射4 mg / kg Poly(I:C)前24h，向C57BL / 6J小鼠靜脈內注射對照脂質體(Lipo)或含Clodronic Acid的脂質體(Cldn)。注射 Poly(I:C) 6h后，給小鼠注射致死劑量的LPS。(K) 由典型和非典型炎癥小體激活觸發的凝血模型。

結論：
(1)炎癥體激活是炎癥和血液凝結之間的重要聯系。
(2)脂多糖通過非典型的炎性體途徑可以激活Caspase-11，釋放GSDMD（裂解骨泌素D），從而導致細胞焦亡，炎癥激活刺激焦磷酸巨噬細胞釋放的組織因子穿過細胞膜，觸發凝血系統，導致宿主死亡。
(3)革蘭氏陰性菌釋放的T3SS桿狀蛋白通過典型的炎性體途徑激活Caspase-1，釋放GSDMD（裂解骨泌素D），從而從而導致細胞焦亡，炎癥激活刺激焦磷酸巨噬細胞釋放的組織因子穿過細胞膜，觸發凝血系統，導致宿主死亡。