LncRNAs功能眾多，也是目前大家的研究熱點。而鐵死亡（ferroptosis）這一新研究內容正在悄悄興起，或成為下一次基金申請中的熱門內容之一。目前認為，鐵死亡是細胞內脂質氧化物的代謝障礙，進而在鐵離子的催化下異常代謝，產生大量脂質，破壞細胞內氧化還原平衡，攻擊生物大分子，觸發細胞的死亡。在鐵死亡研究尚存在眾多謎團的情況下，關于lncRNAs在鐵死亡中的作用研究更是少之又少。下面便給大家分享其中的一篇關于肺癌的研究。

                                                                                                                         文章流程圖
      在前文研究中，作者團隊發現Lymphoid-Specific Helicase （LSH）能與WDR76相互作用并促進如GLUT1、SCD1和FADS2等一系列鐵死亡相關基因的轉錄，進而抑制鐵死亡過程和促進肺癌的發生。在本文中，作者首先提出在LSH調節鐵死亡過程中是否存在lncRNA參與這一問題。作者在LSH過表達后RNA-seq結果中發現了22個差異表達的lncRNA并在H358細胞中通過qPCR驗證了測序結果，之后將研究目標鎖定在表達量上升最高的LINC00336上。與之相對的，敲低LSH之后LINC00336的表達也顯著下降。在肺癌臨床樣品中，LINC00336表達量也顯著高于正常組織。結果如圖1所示。

                                                                                                         圖1 LINC00336表達受LSH調節并且與肺癌預后相關
      接下來作者檢測了LINC00336調控肺癌細胞的各種表型。LINC00336過表達之后，肺癌細胞的增殖、克隆形成和成瘤能力都顯著上升，而鐵死亡水平顯著降低。不同作用機制的鐵死亡激活劑erastin和RSL3處理后，過表達LINC00336都能顯著上調細胞存活。作者檢測了總鐵含量、二價鐵離子含量、膜脂活性氧自由基、線粒體超氧化物和線粒體膜電位一系列鐵死亡標志表型驗證了這一結果。結果如圖2所示。敲低LINC00336之后的結果相反，如圖3所示。

                                                                                                 圖2、圖3 LINC00336促進肺癌細胞增殖、克隆形成和成瘤能力并抑制鐵死亡
 

                                                                                                                      圖4 LINC00336與ELAVL1存在相互作用
       LINC00336如何發揮調控鐵死亡的功能呢？作者首先檢測發現LINC00336定位于細胞核中。于是進一步通過RNA pulldown分析檢測了與LINC00336相互作用的蛋白質。通過反義RNA對照和兩種細胞H358和PC9的重復，作者發現并驗證了ELAV-like RNA-binding protein 1 (ELAVL1)與LINC00336的相互作用。使用ELAVL1抗體進行RIP實驗也有同樣的結果。ELAVL1具有結合RNA并使其更穩定的功能，它識別無m⁶A甲基化的RNA并且結合基序為poly-U或AU-rich。在進行結構預測和結構域分析之后，作者對LINC00336和ELAVL1進行了一系列的截短檢測，最后得出結論：ELAVL1的101-213氨基酸和LINC00336的1901-2107核苷酸相互作用。結果如圖4所示。

                                                                                                                            圖5 ELAVL1促進LINC00336的穩定
       在過表達ELAVL1之后，LINC00336 RNA水平上升，敲低結果相反。放線菌D處理后，過表達ELAVL1使LINC00336降解更慢；敲低結果則相反。結合上述結果，這證明了ELAVL1結合并穩定LINC00336。此外，作者也發現ELAVL1也在LSH過表達后表達量上調。P53也被報道在鐵死亡中發揮著調控作用。一般認為，野生型P53正向調節鐵死亡。該作者在之前的研究中也發現了LSH-lncRNA P53RRA-P53之間的調節作用。因此，作者也檢測了P53在這個過程中的調節作用。結果如圖5所示。

                                                                                                           圖6 LINC00336結合MIR6852進而調控CBS mRNA水平
      LncRNA發揮功能的方式很多。可以通過形成特殊結構結合特定的轉錄因子并激活或者抑制其轉錄活性；可以通過其特異堿基序列引導轉錄因子激活特定基因的轉錄；可以直接影響基因轉錄調控區域的高級結構；可以直接也mRNA結合發揮激活或抑制功能；也可以結合miRNA發揮sponge作用。雖然作者檢測了LINC00336這一細胞核lncRNA的相互作用蛋白，但只研究了對其有穩定作用的ELAVL1，對LINC00336在鐵死亡中的功能仍未解釋完全。于是，作者從sponge作用的角度對LINC00336進行了分析。在miRPathDB Microinspector分析結果中，作者發現了MIR6852能直接結合LINC00336和cystathionine-β-synthase(CBS)；而CBS是鐵死亡過程中硫轉運通路活性的標志蛋白。CBS的高表達降低細胞內的鐵死亡水平。進一步的過表達、敲低和雙熒光素報告基因系統的研究證明了LINC00336通過ceRNA機制吸附MIR6852從而促進CBS的表達。結果如圖6所示。
      本篇文章lncRNA研究思路經典，鐵死亡相關檢測也具有系統性，值得大家參考學習。此外小編仍對LSH過表達后ELAVL1啟動子區域P53結合下降但其mRNA水平升高以及LINC00336相互作用蛋白中是否有其他的轉錄因子或轉錄調控蛋白充滿疑問。歡迎大家解答。