有了RNA-protein 相互作用的研究方法，再也不愁高分的SCI文章了！
熱門研究的非編碼RNA，包含LncRNAs、snoRNAs和mRNA UTR，其許多功能是與RNA結合蛋白(RBPs)直接相互作用實現的。最近研究發現數百種新RBPs的RNA結合域尚不清楚，于是強調RNA蛋白復合物的復雜性和多樣性，進而最新研究成果擴展了RNA-protein 相互作用的兩大類方法：一類方法是以RNA為中心，研究與感興趣的RNA結合的protein；另一類方法是以蛋白質為中心，研究與感興趣的protein結合的RNAs。由于每種方法都有其優勢和局限，選擇最佳方法來處理生物學問題變得非常重要。(Review,Methods to study RNA-protein interactions,IF=28.464)
一、以RNA為中心的方法：發現與感興趣的RNA結合的RBPs
1.以RNA為中心的方法示意圖
以RNA為中心的方法又分體內方法和體外方法。
體外方法：
方法a（1）是用于pull down 實驗的RNA 5 '或3 ' RNA生物素化。末端生物素化RNA與streptavidin beads（鏈霉親和素珠）結合，然后加入細胞提取物孵育后洗滌。此方法不需要洗脫RNA，向beads加入SDS，煮沸，用于蛋白質組學分析。
方法a（2）是感興趣的RNA加適體標簽，例如，S1適體標簽與streptavidin beads結合，生物素可以競爭性地結合streptavidin ，以洗脫標記有S1適體的RNA。已有文獻報導，Cys4 核糖核酸內切酶可以結合Cys4 hairpin loop，用imidazole（咪唑）將核酸酶從發夾環上分離，釋放結合RNA的RBPs。優缺點：降低了非特異性的結果。
方法a（3）標記Cy5染料的體外轉錄（IVT ）RNA雜交到約9400個重組人蛋白(Human ProtoArray)的蛋白芯片。通過熒光檢測結合Cy5 RNA的蛋白質。優缺點：Human ProtoArray方法不需要細胞提取物，有助于發現RNA-protein 相互作用的一種研究方法。然而，這類方法限制于斑點蛋白的折疊結構和翻譯后修飾以及濃度的改變。
體內方法：
甲醛是一種小的雙功能交聯劑，易滲透細胞并在2個單位內交聯大分子，包括蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA和蛋白質-RNA復合物交聯，這種交聯是可逆的。UV light 交聯是一種零距離交聯且不可逆。與甲醛交聯劑相比，UV light 不交聯蛋白質-蛋白質相互作用，特異性強，但效率較低。
方法b（1）是通過蛋白-RNA交聯進而鑒定體內的相互作用。具體內容是在變性條件下去除非共價相互作用來純化RNA，生物素化寡核苷酸探針與感興趣的RNA雜交， RNA和交聯蛋白被純化與鑒定。優缺點：效率低，細胞用量多。
方法b（2）RNA-蛋白質相互作用檢測法簡稱RaPID (LN-HA-Bira)，BoxB RNA莖環側面結合感興趣RNA，在含有生物素的培養基培養細胞，BoxB位點結合融合蛋白（λ-N ），融合蛋白引起與感興趣RNA結合的蛋白生物素化，最后用streptavidin beads捕獲生物素化的蛋白質。
| 方法 | 應用 | 優點 | 缺點 |
| RNA生物素化 | SMN mRNA | RNA末端標記生物素,與鏈霉親和素珠結合強 | 在體外，可能偏好細胞提取物中豐富的蛋白質 |
| S1適體 | ARE motif | 用生物素易洗脫RBP復合物從streptavidin beads | 在體外，可能偏好豐富的蛋白質 |
| Cys4 | Pre-miRNA | 用咪唑洗脫RBP復合物 | 在體外，可能偏好豐富的蛋白質 |
| 蛋白芯片 | TINCR, SNORD50 | 不需要細胞提取物；不需要MS | 在體外，僅與微陣列上的蛋白質直接相互作用 |
| RAP | Xist, FIRRE noncoding RNA | 體內；運用UV交聯和長的寡核酸探針（120nt），特異性高 | 耗費細胞量大 |
| TRIP | p27 mRNA, CEP-1 mRNA | 體內；紫外交聯特異性高。 | Poly(A)和生物素化ASO的捕獲使效率降低 |
| PAIR | ANK mRNA | 體內；紫外交聯特異性高。 | 肽核酸生產耗費成本和精力 |
| MS2-BioTRAP | IRES | 體內；紫外交聯特異性高。 | 需要MS2與RNA的結合，RNA和標簽蛋白的轉染/感染，耗費細胞量大 |
| CHART | Xist, MALAT1, NEAT1 | 體內 | 需要RNase識別探針位置的；耗費細胞量大 |
| ChIRP | TERC, Xist | 體內，探針設計無需要特異性RNA | 短探針可能會拉下類似的片段序列；耗費細胞量大 |
| RaPID | ZIKV-宿主蛋白相互作用 3’端UTR Motifs | 體內；所需細胞數量少；直接標記蛋白質 | 需要BoxB與RNA連接；限制短序列；RNA和標簽蛋白的轉染/感染 |
二、以蛋白為中心的方法：發現與感興趣的蛋白質結合的RNAs
1.蛋白質純化的方法
紫外交聯免疫沉淀結合高通量測序(CLIP-seq)原理
基于RNA分子與RNA結合蛋白在紫外照射下發生耦聯，以RNA結合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質復合體沉淀之后，回收其中的RNA片段，經添加接頭、RT-PCR等步驟，對這些分子進行高通量測序，再經生物信息學的分析和處理、總結，挖掘出其特定規律，在體內與眾多 RNA 靶標的結合模式，并揭示其在一些重要生物學過程中的功能，是一項在全基因組水平揭示 RNA分子與RBP相互作用的革命性技術。能夠確定RBP與RNA直接的相互作用和精確的結合位點。
CLIP-seq 的應用范圍：
（1）繪制全基因組范圍的RNA和RBP相互作用圖譜，解析“Argonaute（Ago）—miRNA—mRNA”三者的相互作用；
（2）RBP與miRNA、lncRNA等非編碼RNA的作用網絡與功能的發現；
（3）與 RIP-seq 相比，可以鑒定RBP和RNA之間的直接相互作用，確定 RBP 與miRNA、lncRNA 等非編碼 RNA 的精確結合位點。
上圖展示了從免疫沉淀到PCR，該圖顯示CLIP-seq的一些重要步驟。例如：XL，UV交聯；IP，免疫反應；磷酸酶，3’端去磷酸化；激酶，5’端磷酸化；RT，逆轉錄；L3，RNA或DNA 3’端適體連接；L5，5’端適體連接；PK提取，從硝基纖維素膜中提取蛋白酶K；Ppt/柱，乙醇沉淀或柱分離核酸；TBE、Tris-B酸鹽-EDTA；SA、抗生物素蛋白。
2.不需要蛋白質純化的方法
在不純化RBP的情況下識別RBP的靶RNA的方法是相對較新的，目前主要是對RNA進行兩種不同化學修飾。第一種是TRIBE，感興趣的蛋白質融合到ADAR酶，在ADAR使附近的腺嘌呤脫氨后，通過測序鑒定脫氨堿基。第二種是RNA標記法，poly(U)多聚酶與感興趣的RBP融合后，添加poly(U)尾到結合的RNA。RNA 3’末端序列識別poly(U)尾；在特定亞細胞區過氧化物酶標記RBP，用于識別結合的RNA，這種方法還沒有被用來鑒定靶RNA。酶修飾RNA的方法是可行的，以后會發現更多的酶修飾RNA。
我們希望更多的技術在這一領域快速發展，多種差異的化學標記分離RBP對于RBP純化組合調控和化學修飾組合研究，以此研究RBP-RNA相互作用的位置。