哺乳動物精子裝載的 small RNA在發育過程中發生顯著改變，因為在附睪的睪丸后成熟過程中，幾波microRNA和tRNA片段被運送到精子。近日，來自美國馬薩諸塞大學醫學院的研究人員Rando在DEVELOPMENTAL CELL（IF=9.616）發表了一篇題為“Small RNAs Gained during Epididymal Transit of Sperm Are Essentialfor Embryonic Development in Mice”的文章，他們利用這一發育過程來探測精子RNA有效載荷在胚胎植入前發育中的功能。他們使用從近端（頭部）與遠端（尾部）附睪獲得的精子通過卵胞漿內單精子注射（ICSI）產生受精卵，然后記錄所得胚胎發育的表型特征。使用頭部精子產生的胚胎在整個植入前發育過程中顯著過度表達多種調節因子，隨后植入效率低下，并且在植入后很快失敗。值得注意的是，將純化的附睪尾部特異性小RNA顯微注射到頭部衍生的胚胎中不僅完全挽救了植入前的分子缺陷，而且還抑制了植入后的胚胎致死性表型。這些發現揭示了哺乳動物精子睪丸后成熟過程中小RNA重塑的重要作用，并確定了對精子傳遞的microRNAs有反應的特定植入前基因表達程序。

技術路線：

主要結果：

1 多個表觀遺傳調控因子在附睪頭部來源精子產生的胚胎中（4細胞，8細胞）的過度表達。

圖1 實驗路線

（A）從近端（頭部）和遠端（尾部）附睪獲得的精子攜帶不同的小RNA群（Nixon et al，2015; Sharma et al ，2016）。（B）不同精子來源（ICSI）的胚培養到指定階段并進行RNA-seq. （C）2細胞階段合子基因組激活（ZGA）的主要波。平均mRNA豐度的散點圖（對于18小時胚胎（前ZGA，x軸）與28小時胚胎（后ZGA，y軸）平均值相比，差異表達的基因（ p <0.05）顯示為紅色和綠色圓點。（D）2細胞階段合子（附睪頭部和尾部精子來源）18、28小時胚胎顯著ZGA基因的熱圖。（E、F）Caput與Cauda胚胎在18小時（E）和28小時（F）的平均mRNA豐度（如C）的散點圖，顯示無顯著差異。

圖2 睪丸后精子成熟對植入前基因調控的影響

（A）附睪頭部和尾部的精子產生的胚全部基因表達對比散點圖，紅色點為37個顯著差異基因（P<0.05）（B）在頭部胚胎中過表達的8個基因與尾部胚胎在單個4細胞胚胎的數據。黑條顯示每組的中值表達胚胎。 *，**和***分別顯示調整后的p值低于0.1,0.01和0.001。（C）4細胞胚后期的基因表達差異。（D）在所有階段95個基因差異表達(p adj <0.1)熱圖。

2 Caput-Derived胚胎在植入后發育中表現出多重缺陷。

圖3附睪頭部的精子在移植后早起發育失敗

（A）   胚胎移植的實驗示意圖。（B）睪丸精子和尾部附睪精子都能夠支持從受精到出生的類似胚胎發育，而頭顱精子獨特地引起調節和發育畸變。Caput和Cauda胚胎的成功率.（C）各自用Cauda或Caput胚胎轉移,從一只雌性中解剖的所有胚胎的圖像。（D）所有胚胎移植解剖的定量分析。

3 睪丸精子和Cauda附睪精子都能夠支持從受精到出生的類似胚胎發育，而Caput附睪精子獨特地引起調節和發育畸變。

圖4 睪丸來源精子產生的胚的分子機制分析

（A）   睪丸來源精子ICSI 過程概要。（B）睪丸精子來源和Canda 附睪來源的胚4細胞時期基因表達的比較。（C-D）比較了4個細胞（C）和胚泡（D）階段的Cauda和睪丸胚胎之間的mRNA豐度（所有基因的中值tpm> 10）散點圖。

4在附睪過渡期間獲得的small RNAs挽救Caput-Derived胚的缺陷。

圖5 Cauda特異性的miRNA恢復Cauda胚的生長。

（A）Cauda特異性的miRNA純化和微注射概要圖。（B）Cauda特異表達抑制的 RNA 過表達在Caput-derived胚。（C）Caput對mRNA豐度的影響（x軸，log 2倍變化Caput / Cauda）對小RNA注射的影響（y軸，log 2倍變化）的散點圖。

5 Cauda特異性small RNAs拯救了Caput-Derived胚胎的發育。

圖6  Cauda特異性MicroRNAs，而不是tRFs，可以挽救Caput植入前的缺陷

（A）   MicroRNAs, tRFs 微注射實驗概況。（B）附睪體RNA的純化。 從Cauda附睪體中純化的兩個重復總RNA樣品的丙烯酰胺電泳。 框顯示了用于微小RNA和tRF的凝膠純化的邊界。（C）單個4細胞期Cauda（n = 23），Caput（n = 23），Caput + microRNA（n = 22）和Caput + tRF（n = 21）胚胎的mRNA豐度，代表性Caput –上調基因。（D）比較Caput效應（x軸）和microRNA效應（y軸）對4細胞期胚胎中mRNA豐度的散點圖（E-F）在4細胞期胚胎（E）和胚泡階段（F）microRNA和tRF對Caput上調基因影響的直方圖。

圖7 Cauda特異性小RNAs拯救Caput胚胎的發展
（A）Small RNA注射流程圖。（B）圖像顯示了由用RNA顯微注射的頭部衍生胚胎產生的成功的實例。下表列出了成功率，如圖3B所示。