目前研究發現,骨髓間質干細胞在心臟疾病的治療中起到重要作用,但具體相關機制還有待闡明。7月19日來自浙江大學第二附屬醫院胡新央、王建安教授團隊在《circulation research》(IF=15.21)發表論文,他們發現,MSCs(MSCs exo)分泌的外泌體可以抑制自噬流,影響P53/Bnip3信號通路從而減少細胞自噬和凋亡。RT-PCR檢測出miR-125B-5p在MSCs exo中是最豐富的,并且增加最多。它可以隨著外泌體的分泌轉移到原生細胞。在使用MSC-exo-anti-miR-125B-5p之后,MSCs對心臟的保護功能受到了抑制。這些研究結果表明,miR125B-5P通過抑制自噬,干擾P53/BNIP3信號轉導從而在MSCs-exo保護心功能中發揮重要作用。
技術路線
研究結果
圖1 間質干細胞移植可以抑制小鼠心肌梗死后的自噬流
A、B:心肌梗死后自噬相關蛋白LC3、P62的表達;C、D:電鏡檢測自噬體;E、F:使用自噬抑制劑后,各組LC3蛋白表達;G、F:從CGA-RPG-GFP LC3轉基因小鼠中,MI后24小時在梗死邊緣區獲得心臟組織切片的代表性熒光圖像。
圖2 MSCs細胞共培養可以抑制自噬流減少細胞凋亡
A、B:WB檢測MSCs細胞共培養后LC3蛋白水平的變化;C:電鏡檢測自噬體的變化;D、E:MRFP-GFP-LC3雙染檢測自噬體與溶酶體的變化;F、G:自噬對缺氧/血清剝奪處理后細胞的影響;H、I:自噬對NMCMs與MSCs共培養后進行造模,細胞死亡的影響。
圖3 NMCMs中缺氧誘導的p53和BNIP3有助于自噬介導的細胞死亡
A、B:WB檢測細胞中p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK、P53、Bnip3蛋白表達變化;C、D:WB檢測組織中P53、Bnip3蛋白表達變化;E-H:p53、Bnip3腺病毒轉染檢測自噬蛋白LC3的變化;I-L:熒光染色檢測評價p53、Bnip3腺病毒轉染后細胞的死亡;M-P:熒光染色檢測Atg7siRNA干擾且經過p53、Bnip3腺病毒轉染后細胞的死亡。
圖4 p53介導的自噬誘導的細胞死亡是BNIP3依賴的
A-D:WB檢測p53siRNA、Bnip3 siRNA干擾后P53、Bnip3 蛋白表達情況;E、G:WB檢測p53siRNA、Bnip3 siRNA干擾后LC3蛋白表達情況;I、J:WB檢測P53轉染NMCMs后,LC3蛋白表達;K-N:熒光染色檢測P53siRNA、Bnip3 siRNA干擾后細胞死亡狀況;O-P:熒光染色檢測Bnip3 siRNA干擾且轉染腺病毒p53后細胞死亡狀況。
圖5 骨髓間充質干細胞可調節NMCMs的自噬流,增強細胞活力
A、B: WB檢測MSCs來源的外泌體處理NMCMs細胞,LC3蛋白表達的變化;C、D: mRFP-GFP-LC3熒光染色檢測MSCs-exo孵育NMCMs細胞后對自噬體和自噬溶酶體的影響;E、F: 熒光染色檢測MSCs-exo對細胞死亡的影響;G、H:WB檢測MSCs-exo孵育NMCMs細胞后p53和Bnip3 蛋白表達的影響。
圖6 MSC-125B-5P在骨髓間充質干細胞中的丟失導致其在體外的自噬調節和心臟保護功能喪失
A:RT-PCR檢測骨髓間充質干細胞中的外泌體中miRNA的含量;B:細胞中mir-125B-5P水平最高;C、D:WB檢測加或不加anti-miR-125b后LC3蛋白的表達;E、F:mRFP-GFP-LC3熒光檢測加或不加anti-miR-125b后自噬體與自噬溶酶體的變化;I、J:WB檢測加或不加anti-miR-125b后p53、Bnip3蛋白的表達。
圖7 MSC-125B-5P在骨髓間充質干細胞中的丟失導致其在體內的自噬調節和心臟保護功能喪失
圖8 MSC-125B-5P在骨髓間充質干細胞中的丟失導致MI后心臟功能恢復受到障礙
A、B: exo處理可以減少心肌梗死面積;C-G:超聲心電圖顯示exo處理可以改善小鼠MI后的心功能。