乳腺癌是多樣化疾病，并且三陰性乳腺癌（TNBC）仍然是一個很嚴重的健康問題。已有研究報道，LINC01638（基因間長非編碼蛋白RNA 1638）在人類正常組織中低表達，并且還參與了肝癌細胞的EMT過程。關于lncRNAs在TNBC進展中潛在作用仍然沒有探究。鑒于以往研究成果，Guopei Zheng和Xiaoming Xie帶領的團隊進一步探究了LINC01638在TNBC中的功能，并于2018年6月8日在Oncogene雜志（IF=7.5）上發表了這篇文章。這篇文章證明了LINC01638在TNBC組織和細胞中顯著上調，并且能夠維持TNBC細胞中的間質特性，包括含有豐富的上皮間質間轉換（EMT）信號和癌癥干細胞狀態。下調LINC01638能夠在體外和體內抑制細胞增殖和轉移。過表達LINC01638預示著對乳腺癌病人有不良的預后效果。LINC01638能與c-Myc相互作用，能夠抑制SPOP調節的c-Mcy的泛素化和降解。C-Mcy能夠提高MTDH的表達，進一步激活Twist1的表達，最終誘導EMT。該文章的結果證明，LINC01638能夠調節轉導信號，并且突出了LINC01638在TBNC發張過程中所扮演的重要角色。

技術路線

結果

圖1. 在TNBC亞型中，LINC01638 lncRNA上調

A. qRT-PCR檢測 LINC01638在不同乳腺癌亞型組織中的表達情況。B. qRT-PCR檢測LINC01638在BC細胞系中的表達情況。CD. 在線分析LINC01638轉錄本中蛋白編碼和核糖體結合位點。EF. 全長LINC01638或ORF克隆到真核表達載體（pCMV-Flag）中，在這兩種不同的表達模式下，加或不加N-末端密碼子ATG，MDA-MB -231細胞被轉染后進行WB檢測，p21作為陽參。Flag-抗體用于轉錄后蛋白的標記，黑色箭頭指p21-Flag蛋白。G. 利用qRT-PCR對MDA-MB -231細胞進行分餾，BCAR4作為核基因的陽參，GAPDH作為胞質基因的陽參。

圖2.LINC01638能夠促進BC細胞的間質性特點

A. 通過轉染LINC01638 shRNA，建立LINC01638下調的穩定MDA-MB-231和BT549細胞系。B. 下調LINC01638抑制MDA-MB-231和BT549細胞的增殖。C. 通過轉染EXP-LV203-LINC01638載體建立穩定表達LINC01638的T47D細胞系（左），過表達LINC01638促進T47D細胞的增殖。D. 克隆的細胞進行transwell。E. LINC01638下調或過表達后進行克隆后，FACS檢測CD44+CD24-(CSC)亞群的表達。F. LINC01638下調或過表達進行克隆后，進行微球體形成實驗。G. qRT-PCR檢測檢測細胞克隆條件下EMT的表達水平。H. WB檢測EMT的marker。

圖3.LINC01638能夠通過MTDH調節間質特點

A. qRT-PCR檢測在不同的乳腺癌亞型組織中MTDH的表達情況（左），在組織中LINC01638和MTDH的表達相關性（右）。B. qRT-PCR和WB檢測MTDH在細胞系的的表達情況。C. 下調LINC01638后，MTDH表達下調（上）；過表達LINC01638后，MTDH上調（下）。D. 在MDA-MB-231細胞中，過表達MTDH能夠抵消下調LINC01638后導致的增殖、侵襲和產生CD44+/CD24? (CSC)亞群的效應。E. 在T47D細胞中，下調MTDH的表達能夠抵消過表達LINC01638后導致的增殖、侵襲和產生CD44+/CD24? (CSC)亞群的效應。F. 在MDA-MB-231細胞中，過表達MTDH能夠抵消下調LINC01638后導致的EMT的效應。G. 在T47D細胞中，下調MTDH的表達能夠抵消過表達LINC01638后導致的EMT的效應。

圖4. MTDH在BC細胞中能夠被c-Mcy調節

A. 預測c-Myc在MTDH啟動子中的結合位點。BC. qRT-PCR（B）和WB（C）分別檢測再細胞系中c-Myc下調或過表達后MTDH的表達情況。D. 通過ChIP-qPCR檢測，c-Myc主要結合在MTDH啟動子的B位點。E. ChIP-qPCR檢測顯示，影響c-Myc的表達水平后能夠影響c-Myc與MTDH啟動子的結合水平。F. 在BC細胞系中，通過熒光酶報告系統檢測MTDH啟動子活性與c-Myc的相關性。

圖5.LINC01638與c-Mcy相互作用抑制SPOP調節的降解

A.通過在線軟件分析TCGA數據，比較c-Myc在乳腺癌和正常乳腺中的表達情況。B. WB檢測，下調LINC01638后MG-132對c-Myc表達水平的調節效果。C. WB檢測，下調LINC01638后下調SPOP對c-Myc表達水平的調節效果。D. RIP驗證LINC01638和c-Myc、SPOP的相互作用。E. CoIP驗證c-Myc和SPOP的相互作用。F. Mapping分析c-Myc與LINC01638相互作用域。全長LINC01638 和縮短LINC01638片段的原理圖（左）；在293T細胞中，RIP驗證縮短LINC01638片段與c-Myc的相互作用（右）。G. 識別c-Myc蛋白與LINC01638相互結合的區域。c-Myc蛋白的片段（左），在293T細胞中，RIP驗證LINC01638與c-Myc的相互作用區域（右）。H. LINC01638對c-Myc核定為的影響。 I. 在MDA-MB-231細胞中，過表達c-Myc能夠抵消下調LINC01638后對增殖和侵襲的效應。在T47D細胞中，下調c-Myc能夠抵消過表達LINC01638后對增殖和侵襲的效應。

圖6.LINC01638能夠在體內促進乳腺癌的腫瘤進展

A. 下調LINC01638能夠抑制MDA-MB-231細胞來源的腫瘤的生長，上調c-Myc的表達會抵消LINC01638的下調效應。B. 通過尾靜脈注射下調LINC01638的MDA-MB-231細胞，下調或過表達c-Myc后，HE染色小鼠肺轉移結點。C.在乳腺癌組織中，ISH染色LINC01638蛋白，IHC染色c-Myc、MTDH、Twist1蛋白。D. Kaplan–Meier分析高表達LINC01638后與乳腺癌病人預后的相關性。