LncRNA-mRNA整合分析

1．LncRNA簡要

LncRNA是一類轉錄本長度超過200nt的RNA，它們本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）調控基因的表達水平。生物體內含量相相當豐富，約占RNA的4-9%（mRNA約占1-2%）。LncRNA的組織特異性及特定的細胞定位，顯示lncRNA受到高度嚴謹的調控，目前已知其與發育、干細胞維持、癌癥及一些疾病相關。雖然近年來隨著基因芯片及第二代高通量測序技術的廣泛運用，lncRNA不斷被發現，但此類轉錄本的確切功能還未知。目前市場上的lncRNA芯片通常將lncRNA與mRNA設計在一起，RNASeq數據中也包含lncRNA, mRNA序列，因此可以通過分析lncRNA與mRNA表達相關性對lncRNA進行功能注釋。 

2．分析流程圖

3. 分析內容

①計算LncRNA與mRNA表達相關性，根據設定的域值篩選lncRNA與mRNA關系對，構建LncRNA與mRNA共表達網絡，如下是全局網絡

 ②基于lncRNA與mRNA表達相關性以及lncRNA與mRNA基因組位置近鄰關系，得到lncRNA的潛在靶標基因，對差異表達的lncRNA靶標基因進行功能注釋以及功能富集分析，如下是功能富集的GO的Barplot圖和差異lncRNA的Heatmap圖

③研究lncRNA與mRNA的共表達網絡的拓撲學特性，基于度篩選網絡拓撲上重要的lncRNA，這些lncRNA極有可能是與研究背景相關的lncRNA，如下是重要lncRNA與mRNA的局部共表達子網絡

 ④客戶提供研究背景相關一組基因，根據表達相關性可以找出與這組基因相關的lncRNA，從而構建出感興趣的共表達網絡。通過構建的共表達網絡能進一步找到感興趣的 hub  lncRNA。

 

lncRNA深度挖掘分析

一、差異lncRNA靶基因預測

lncRNA的靶基因較為復雜,主要分為正式和反式兩種作用機制.lncRNA作用機制與miRNA類似,均可以通過調控相應的mRNA來行使功能,所以靶基因的預測在科學研究中都顯得非常必要。

二、靶基因Gene Ontology分析
我們將靶基因向gene ontology數據庫的各節點映射,計算每個節點的基因數目.

三、靶基因Pathway分析

信號通路分析需要完備的注釋信息支持，通過整合KEGG、Biocarta、Reactome等多個數據庫的信息可以精確檢驗來進行Pathway的顯著性分析。

四、lncRNA與調控基因的表達機制

通過整合lncRNA的信息和靶基因之間的關系,我們可以得到一個lncRNA與靶基因之間的調控網絡圖.

五、 轉錄因子結合位點預測

對于差異表達lncRNA，提取轉錄起始位點上下游序列,使用預測程序對其轉錄因子結合位點進行預測.

六、基因關聯分析

現在市面上的lncRNA芯片均含有mRNA的表達探針,通過將lncRNA的靶基因分析結果與芯片上mRNA的表達結果做關聯分析,可以更進一步的分析lncRNA的功能。

七、信號通路調控網絡構建：

實驗中基因同時參與了很多Pathway，通過構建信號通路調控網絡，從宏觀層面看到Pathway之間的信號傳遞關系，在多個顯著性Pathway中發現受實驗影響的核心Pathway，以及實驗影響的信號通路之間的調控機理。

八、lncRNA的功能分析

根據lncRNA最新的功能數據庫，利用生物信息學工具，做出Function-Tar-Net圖表，從而得出lncRNA與功能的關系

lncRNA功能實驗

1、LncRNA定量PCR

2、LncRNA原位雜交

3、5’-RACE, 3’-RACE實驗(lncRNA全長擴增實驗)

4、lncRNA干擾實驗

5、lncRNA過表達實驗

需要先通過5’-RACE實驗找到lncRNA轉錄起始位點

6、lncRNA細胞功能實驗

細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、細胞遷移