一、結合重亞硫酸鹽的測序法實驗流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）

原理：結合重亞硫酸鹽的測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞硫酸鹽處理后，用針對改變后的DNA序列設計特異性引物并進行聚合酶鏈式反應（PCR）。 PCR產物中原先非甲基化的胞嘧啶位點被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位點保持不變。PCR產物克隆后進行測序。通過這個方法能得到特定位點在各個基因組DNA分子中的甲基化狀態。

該方法特點是：
1. 特異性高，它能夠提供特異性很高的分析結果，這是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比擬的；
2. 靈敏度高，可以用于分析少于100個細胞的檢測樣品。用微量的基因組DNA進行分析就能得到各個DNA分子精確的甲基化位點分布圖。
  
                   圖1 結合亞硫酸鹽的測序法流程圖
DNA用重亞硫酸鹽處理后進行PCR擴增，擴增片段純化后連接進載體，轉化大腸桿菌，過夜培養后挑單個陽性克隆進行測序。得到每個DNA分子特定區域甲基化位點的分布圖。
 
結合重亞硫酸鹽測序法技術實驗流程
A．DNA制備
用DNA抽提試劑盒（Promega, cat. no. A1125）抽提組織，細胞培養物，石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA。
B．重亞硫酸鹽處理
C．DNA純化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)純化重亞硫酸鹽處理后的DNA樣品。
D．DNA脫磺基反應
E．PCR擴增
F．PCR產物瓊脂糖電泳后回收純化，隨后連接到pGEM-T EASY 載體中克隆及測序。
 

二、甲基化特異性的PCR實驗流程
（methylation-specific PCR, MSP）

原理：甲基化特異性的PCR是一種靈敏度高且操作相對簡單的甲基化研究方法。重亞硫酸鹽處理DNA后，基因組DNA發生的由甲基化狀態決定的序列改變。隨后進行引物特異性的PCR。該方法引物設計是關鍵。MSP中設計兩對引物，即一對結合處理后的甲基化DNA鏈（引物對M），另一對結合處理后的非甲基化DNA鏈（引物對U）。檢測MSP擴增產物，如果用引物M能擴增出片段，則說明檢測位點存在甲基化；若用引物U擴增出片段，則說明被檢測的位點不存在甲基化（圖3）。

該方法優點是：
1、檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需1μg的基因組DNA，可用于石蠟包埋樣本；
2、快速、簡單，省時；
3、如果結合Real-time定量PCR技術（Taqman 探針）則能對樣品中檢測位點的甲基化水平進行定量檢測(Methylight)。 

           圖2 甲基化特異性的PCR（MSP）流程示意圖
用亞硫酸鹽處理后DNA分子發生了由甲基化狀態決定的序列改變。用甲基化特異性的引物（primer M）和非甲基化特異性的引物（primer U）進行擴增。只有結合完全的甲基化或

MSP技術實驗流程
A．DNA抽提
用DNA抽提試劑盒（Promega, cat. no. A1125）抽提組織，細胞培養物，石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA。
B. 重亞硫酸鹽處理
C．DNA純化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)純化重亞硫酸鹽處理后的DNA樣品。
D．DNA脫磺基反應
E．甲基化特異性的PCR反應
針對改變后的DNA序列設計兩對引物（M，U），進行PCR反應。為了避免非特異性擴增用TaKaRa的hotstart酶。隨后對PCR產物的凝膠電泳圖進行分析。
實例：
檢測肝癌細胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因啟動子甲基化。重亞硫酸鹽處理后，針對改變的DAN序列設計兩對引物
M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp
U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp
 
圖3：PCR擴增結果圖

三、高分辨率熔解曲線（HRM）法 

     高分辨率熔解曲線分析技術（High Resolution Melting ），簡稱HRM ，是近年來興起的一種檢測基因突變、進行基因分型而及甲基化檢測的新方法。基本原理是基于核酸分子由于片段長短、GC含量、GC 分布及單個堿基差異等物理性質不同而造成DNA 分子在加熱變性時都會有不同的熔解曲線的形狀和位置，并配合運用高濃度的飽和熒光染料，可以迅速的檢測出核酸片段中GC含量和單堿基的突變。近年來，公司引進了Roche LightCycler? 480 II 和ABI VIIA7 全自動熒光定量PCR系統，為客戶提供專業化、個性化的甲基化HRM檢測服務。

操作流程：
﹡待測基因序列片段或位點甲基化引物設計（300bp以內）。
﹡利用甲基化轉移酶修飾的DNA和非甲基化修飾的DNA制備標準品（0％，1％，5％，10％，20％，50％，100％梯度HRM標準曲線）
﹡亞硫酸氫鹽處理樣品DNA
﹡上機檢測
﹡數據處理，形成報告（包括實驗過程、試劑耗材、熒光PCR儀原始文件、測序文件等）。
實驗實例：
     對2個病例的某基因20個CG位點進行檢測，分析出不同的甲基化程度。

四、焦磷酸測序法 

     焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術是由4種酶（DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、熒光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。每一輪測序反應體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果該dNTP與模板配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3'末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。摻入的dNTP和釋放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸測序檢測法基于引物延伸的Pyrosequencing技術，通過將鏈合成過程中釋放出的焦磷酸(PPi)轉化成光信號來監測鏈的合成過程。通過檢測CpG對應位點上C/T滲入的比例對目標位點的甲基化程度進行定量分析方法。

操作流程：
﹡DNA亞硫酸鹽處理
﹡用焦磷酸測序專門引物設計軟件設計甲基化引物
﹡進行PCR擴增預實驗及正式實驗
﹡PCR產物上焦磷酸測序儀檢測
 
實驗實例：

各種方案比較

服務說明
 
①樣品要求：
﹡血液樣品：樣品為EDTA抗凝或枸椽酸鈉抗凝，樣品量大于0.5 ml，樣品采集后于-20℃或-80℃保存，低溫（≤-4℃）運輸。
﹡組織樣品：樣品可以為新鮮組織（最好-80℃保存）或石蠟包埋的組織，也可以是95%乙醇中固定的組織，組織量大于100 mg。
﹡DNA樣品：純度OD260/280 比值為1.8-1.9，濃度≥50ng/ul，體積≥50ul。
②提供詳細的基因信息
     BSP方法要求待測序列≤300bp，HRM待測序列≤200bp，HRM待測序列≤200bp，焦磷酸測序待測序列≤60bp，且上下游保留200bp用于引物設計；MS方法要求提供待測序列的CG侯選位點。我們會根據客戶的基因序列信息選擇不同的檢測方法，并在方案實驗過程中隨時與客戶溝通。
③提供結果  
    實驗報告（實驗步驟，包括BSP法的5個克隆統計結果等)、PCR電泳照片、測序彩色波形圖、HRM標準曲線圖、焦磷酸測序原始文件、基因芯片的原始文件等。

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