Oncogene:缺氧誘導的外泌體促進卵巢癌更具侵襲性和化療抗性:一種連接STAT3 / Rab蛋白的新機制

眾所周知，所有的真核細胞通過分泌稱為“外泌體”的小囊泡（大小為40-100nm），跨膜轉運遺傳信息來保持與局部環境的接觸。外泌體在包括癌癥在內的許多疾病的發展中發揮重要作用。缺氧被認為是促進上皮腫瘤擴散的關鍵因素，缺氧介導的腫瘤進展、轉移和耐藥性是卵巢癌的主要臨床挑戰。在缺氧腫瘤微環境中釋放的外泌體可能通過在癌細胞和正常細胞之間轉移信號蛋白而促成這些臨床難治表型。

近期發表在Oncogene（IF=7.519）上的文章《Hypoxia-induced exosomes contribute to a more aggressive and chemoresistant ovarian cancer phenotype: a novel mechanism linking STAT3/Rab proteins》發現處于缺氧環境的卵巢癌細胞通過上調Rab27a，下調Rab7、LAMP1 / 2、NEU-1以及促進更偏分泌型溶酶體表型而顯著增加其外泌體釋放。研究結果表明，缺氧環境中卵巢癌細胞衍生的外泌體（HEx）在增強卵巢癌轉移/化療耐藥性方面更有效，可能成為腫瘤轉移，化療耐藥和改善臨床結局的干預措施之一。

技術路線

實驗結果

1. 常氧卵巢癌細胞分泌的外泌體（NEx）和低氧卵巢癌細胞分泌的外泌體（HEx）的分離、鑒定和蛋白質組學研究

Figure 1

圖1 外泌體的分離和鑒定 A）B）納米粒子跟蹤分析（NTA）結果顯示相對于永生化卵巢上皮細胞(IOSE385、386)和永生化輸卵管分泌上皮細胞（FT-33），卵巢癌細胞系（OVCAR8、TR127、TR182）的外泌體濃度明顯更高，而外泌體的大小沒有明顯差異。C）低溫透射電子顯微鏡驗證OVCAR8和TR127細胞的大小形態。D）常氧條件下，Western blot實驗證實在OVCAR8和TR127細胞分離的外泌體裂解物中有外泌體表面標志物EpCAM、TSG101和CD63的存在，順式高爾基體蛋白GM130用于驗證囊泡純度。E)分別在常氧和低氧條件下孵育卵巢癌細胞，評估氧張力對其釋放外泌體的影響，結果顯示，缺氧時不同細胞系釋放外泌體的量是常氧條件下的3-6倍。F）分別對常氧和缺氧環境下腫瘤細胞來源外泌體進行LC-MS/MS質譜分析，篩選差異蛋白后做GO富集分析，結果表明與來自OVCAR8細胞的常氧外泌體相比，缺氧外泌體中大多數外泌體蛋白與細胞過程，代謝過程和生物調節相關。G）外泌體蛋白質組數據集的IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析顯示數據集中確定的生物分子列表與前六種不同的疾病和功能相關。

2.分泌型溶酶體表型有利于缺氧時外泌體的釋放

Figure 2

圖2 缺氧有利于增加溶酶體與質膜的對接A）B）用共聚焦顯微鏡觀察卵巢癌細胞系（A2780和OVCAR8）顯示缺氧會增加卵巢癌細胞釋放外泌體，蛋白質含量也顯著增加。C）競爭ELISA法檢測結果顯示，缺氧時溶酶體胞外分泌的β-氨基己糖苷酶A濃度增加，并通過使用BAF-A1（自噬抑制劑）與常氧處理OVCAR8進一步驗證。D）IOSE在常氧下顯示溶酶體的核周定位。E）從患者腹水（低氧環境）分離的細胞中進一步證實了LAMP1（綠色）的周邊溶酶體共定位（紅色）。F）與常氧相比，低氧條件下LAMP1/2的mRNA表達顯著增強，且NEU-1（溶酶體胞吐作用的負性調節劑）的mRNA表達下調。

3. 評估Rabs和STAT3在外泌體釋放中的作用

Figure 3

圖3在缺氧條件下Rabs表達的改變：STAT3在囊泡轉運過程調節Rab7和27a  A）B）Rab7和27a的蛋白和mRNA表達在常氧和缺氧條件下呈負相關。C）缺氧條件下敲減（KD）STAT3會顯著減少外泌體濃度。D）與OVCAR8 WT（缺氧）相比，STAT3 KD增加了Rab7的表達并顯著降低了Rab27a的表達。E）分別測量STAT3過表達（OE）、敲減和 OVCAR8細胞的外泌體濃度，顯示STAT3過表達外泌體濃度顯著增加，敲減STAT3使得外泌體濃度減少。F）比較缺氧OVCAR8-WT和STAT3 KD的結果，顯示后者溶酶體數量顯著減少。G）分別測量OVCAR8-HC、HIF(缺氧誘導因子) KD和STAT3 KD中外泌體濃度，敲減STAT3后外泌體濃度明顯減少，而敲減HIF不會造成明顯影響。

4. 評估HEx在體外遷移/入侵中的作用

Figure 4

圖4 外泌體內化及其對受體細胞中腫瘤遷移和轉移的影響 A）將HEx用System Biosciences-SBI標記，并與條件培養基中的OVCAR8細胞共培養，共聚焦顯微鏡證實24h后外泌體內化。B）運用Image J軟件分別定量低氧條件和非低氧條件下，正常細胞（IOSE和FT-33細胞）和卵巢癌細胞系(OVCAR8)的遷移百分比，結果低氧條件下遷移率均有所上升。C）D）用細胞入侵Transwell測定試劑盒分析OVCAR8細胞的侵襲性潛力，結果顯示與HEx共培養后侵入膜的細胞數目顯著增加，OVCAR細胞遷移百分比上升。E）NEx和HEx與條件培養基中的A2780和OVCAR8細胞在常氧下共培養一周，發現致癌蛋白（T/pSTAT3、Tyr705）和參與遷移/侵襲的蛋白質（MMP2）含量增加。F）進一步證實STAT3在IOSE和OVCAR8細胞系的外泌體中的表達，且它的活化形式僅在缺氧時從OVCAR8分離的外泌體內觀察到。G）與從細胞計數標準化的永生化癌細胞釋放的量相比較，患者腹水細胞釋放高水平的外泌體。H）來自同一患者的原發性卵巢腫瘤組織（OT），腹水(Asc)和轉移組織(Met)中的pSTAT3表達顯示腹水和轉移部位與原發腫瘤部位相比STAT3活化增加。I）在從EpCam表達正常化的患者腹水中分離的外泌體中證實了癌蛋白例如STAT3，pSTAT3和FAS的表達。J）遷移實驗使用從STAT3 WT和STAT3 KD細胞分離的外泌體證明了外泌體STAT3對OVCAR8細胞遷移有重要作用。

5.使用原位卵巢腫瘤模型評估HEx在體內的腫瘤進展和轉移潛能

Figure 5

圖5HEx增強腫瘤轉移并能重新編程正常細胞 A）B）在與NEx和HEx共同培養3周后，用POCC（原發性卵巢癌細胞）外泌體處理的OVCAR8細胞注射小鼠卵巢囊。與注射OVCAR8 NEx的對照小鼠相比，注射OVCAR8 HEx的小鼠腫瘤重量顯著增加。C）D）注射與HEx共培養的OVCAR8細胞的小鼠中的轉移性結節的數目顯著高于注射與NEx共培養的OVCAR8細胞。E）在注射了輸卵管分泌細胞的小鼠中進行了類似的實驗，這些細胞與NEx和HEx共同培養后沒有觀察到腫瘤，但與HEx共同培養的輸卵管形態發生顯著變化。F）與NEx或對照組相比，HEx組卵巢的輸卵管重量顯著增加。G）（i）注射永生化FT細胞的對照小鼠輸卵管（FT）的蘇木精和伊紅（H＆E）染色切片，其表面上皮和由基質隔開的腺體可見，沒有細胞異型性；（ii）注射HEx處理的FT細胞后，有上皮細胞增殖，沒有介入基質，非典型多形核被識別；（iii）注射永生化FT細胞的對照小鼠FT的Ki67染色與注射HEx處理的FT細胞小鼠后的（iv）FT切片相比顯示出不足的核標記。H）使用針對Ki67（綠色）/ CK8（紅色）和ki67（綠色）/ CD31（紅色）（箭頭表示共定位）的單克隆抗體，在正常和HEx處理的輸卵管的冷凍組織切片中進行免疫熒光雙標記，Hoechst 3342染色顯示所有細胞核。I）和對照組相比，注射HEx共培養的FT細胞的小鼠FT組織切片的免疫熒光染色合并通道顯示，IL-6（DAPI-藍色/ IL-6-紅色）和pSTAT3（DAPI-藍色/ pSTAT3-紅色）表達水平的增加。

6.HEx對卵巢癌細胞耐藥性的影響

Figure 6

圖6 HEx參與化療抗性 A）比較卵巢癌控制（順鉑治療之前）、順鉑敏感性（治療后6個月無復發）和順鉑耐藥性（治療后6個月復發）的患者樣本，發現順鉑治療后，血清外泌體的濃度顯著增加。B）在常氧和缺氧條件下培養不同的卵巢癌細胞系，用ICP-MS測量順鉑處理后外泌體中順鉑的濃度，結果顯示缺氧時順鉑外排明顯增加。C）磺酰羅丹明測定法測定結果顯示，與對照組相比，OVCAR8細胞和Hex共培養后細胞增殖百分比增加。D）E）與未經任何外泌體處理的OVCAR8細胞相比，經HEx預處理的OVCAR8細胞用順鉑處理24小時后，?H2Ax陽性細胞增加。F）與未經外泌體處理的OVCAR8細胞相比，經HEx處理的OVCAR8細胞中C-PARP、CC-3和CC-7的凋亡蛋白表達降低。泳道：1（對照），泳道：2（DMSO），泳道3（HO3867-10μM，STAT3抑制劑），泳道4（順鉑-10μM），泳道5（HO3867 + CP）。G）NTA定量測定結果顯示，缺氧條件下OVCAR8細胞的外泌體濃度經阿米洛利處理后顯著降低。H）共聚焦顯微鏡觀察到，在缺氧條件下用阿米洛利處理的OVCAR8細胞與用順鉑處理的OVCAR8細胞相比，溶酶體的外周定位減少。I）J）OVCAR8細胞的細胞存活數量和集落形成分析表明，與對照組相比，阿米洛利單獨治療時沒有細胞毒性，但與順鉑一起治療時，細胞毒性效應增加。                                            

結論

在卵巢癌細胞中敲減STAT3會減少外泌體釋放，這一作用是通過在低氧條件下改變Rab家族蛋白Rab7和Rab27a來實現的。低氧條件下培養的來自患者腹水的卵巢癌細胞系分泌的外泌體攜帶更有效的致癌蛋白STAT3和FAS，能夠顯著增加細胞遷移/侵襲和體外化學耐受性以及體內腫瘤進展/轉移。HEx能夠精確地重新排列無限增殖的輸卵管分泌上皮細胞（FT），使其在小鼠輸卵管中變成促致癌細胞。此外，在低氧條件下，通過外泌體的順鉑外排在卵巢癌細胞中顯著增加。 HEx與腫瘤細胞的共培養導致雙鏈DNA損傷顯著減少并且影響對順鉑治療的應答而增加細胞存活。通過已知抑制劑阿米洛利或STAT3抑制劑阻斷外泌體的釋放并用順鉑處理導致細胞凋亡顯著增加，減少集落形成和擴散。

圖7低氧卵巢癌細胞示意圖，表示STAT3介導的外泌體釋放信號級聯有助于轉移和化學反應，并且還顯示了用于標準化療干預措施的有希望的檢查點（綠色條）。