高分文章揭示細胞核circRNA新機制

   很多人都會有這樣的疑問， circRNA定位在細胞核中嗎？其實，環狀RNA（Circular RNA, CircRNA）主要在細胞漿中富集，只有少數定位于細胞核。目前文章報道的circRNA 主要定位于細胞質中，通過ceRNA機制發揮作用。那么細胞核中的circRNA 又具有什么功能呢？4月3日，知名免疫雜志Immunity （IF=22.8）發表了中科院生物物理所范祖森教授課題組的文章，首次報道 circRNA Cia-cGAS（作者以結合的蛋白命名）定位于細胞核中，通過結合cGAMP合成酶cGAS并抑制其酶活性，降低IFNs表達，維護靜息狀態的長效造血干細胞（LT-HSC）免受耗竭。（文章題目：A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion）。

   成人造血干細胞（HSC）在骨髓內多以靜息狀態存在，同時保持著自我更新和分化的潛能，自我更新與分化穩態的破壞會導致骨髓衰竭或血液惡性腫瘤。長期造血干細胞（Long-term HSCs , LT-HSCs）作為潛能最高的干細胞系，為短期造血干細胞（ST-HSC）、多能干細胞（MPP）等祖細胞提供了持續性細胞補給。然而，HSCs如何維持其靜息狀態，并避免I型干擾素(IFN)介導的衰竭尚未清楚。

研究路線：

1確定目標circRNA

為研究circRNAs對HSCs自我更新的影響，作者采用小鼠circRNA芯片在LT-HSCs 和MPPs兩種細胞中篩選差異表達circRNA，結果發現49個circRNA 在LT-HSCs中上調 （A），RT-PCR驗證到9個上調circRNA (B)；northern blot鑒定這些circRNA (C)后， 進一步將這9個circRNA對應的 shRNAs 慢病毒移植小鼠發現只有Cia-cGAS影響HSCs的亞群分布 (D,E,F,G)，同時確定干擾母基因線性RNA并無明顯表型。接下來就是在小鼠不同組織，不同類型細胞中通過northern blot 和RT-PCR（一對convergent引物、一對divergent引物）驗證Cia-cGAS的存在性，普遍性和保守性 (H,I,J)。并通過FISH和核質分離PCR發現Cia-cGAS位于細胞核中(K,L),其對應線性RNA位于細胞質而(附圖)。

2.Cia-cGAS具有哪些功能？（維持LT-HSCs的靜息狀態）

作者通過迷你系統迷你基因載驗證Cia-cGAS序列上下游內含子中的反向互補序列是成環的關鍵，因此在內含子反向互補序列處設計引物，通過CRISPR/Cas9在小鼠內進行Cia-cGAS敲除 （A,B,C）。分離小鼠骨髓HSC細胞通過流式確定敲除Cia-cGAS后LT-HSCs細胞數和百分比下降(D,E,F)，且成熟的造血細胞數量也下降(H)，骨髓切片HE染色發現有核細胞減少(G)。同時BrdU腹腔注射小鼠后流式分析LT-HSCs的BrdU信號，發現Cia-cGAS敲除后BrdU信號增強(I)；細胞周期分析LT-HSCs表明現，Cia-cGAS敲除處于S/G2/M活躍狀態的后LT-HSCs細胞數增多 (J)。這些結果表明Cia-cGAS維持LT-HSCs的靜息狀態。

3.Cia-cGAS通過哪些基因調控LT-HSCs的靜息狀態 ？（IFN）

確定circRNA 功能后，接下來作者研究其作用機制。通過mRNA芯片在cia-cGAS+/+ 和cia-cGAS–/– LT-HSCs中篩選差異表達基因(A)。篩選上調的已報道調控HSC活躍狀態的IFN。并通過PCR 和ELISA 驗證IFN的表達（B,C）. 通過回復實驗，確定IFN敲除 后能回復cia-cGAS敲除造成的靜息破壞（E,F,G,H）

4.Cia-cGAS通過什么機制調控IFN?  (結合蛋白cGAS)

因為Cia-cGAS位于細胞核中，所以其可能通過結合蛋白（如：酶類，轉錄因子）來調控mRNA的合成。作者以Cia-cGAS對應的線性RNA為探針進行RNA pull down,通過質譜篩選拉下的蛋白（A），篩選到已報道通過合成GAMP, 而調控IFN 的合成酶cGAS。進一步，通過特異抗體WB 和RIP驗證（B,C）. 接下來確定Cia-cGAS和cGAS共定位：免疫熒光，質分離WB,和免疫熒光共定位（D,E,F）.  進一步確定結合位點：生物信息學分析Cia-cGAS對應線性RNA的二級結構（G）, 位點突變后進行EMSA 和AlphaScreen （H,I,J,K）

5.Cia-cGAS 對結合蛋白的調控？ （抑制其酶活性）

cGAS 通過結合DNA，催化cGAMP合成。因此作者研究Cia-cGAS結合cGAS對其結合DNA能力的影響。通過競爭性EMSA試驗，對cGAS孵育不同量的Cia-cGAS看其結合DNA 的能力變化（A）,并反面驗證（B）; 同時用RNA pull down 和DNA pull down 驗證 （C,D）。通過TLC，ChIP， reverse phase-HPLC，luciferase assay 驗證Cia-cGAS敲除對cGAMP合成的影響 （E,F,G,H）.

6.Cia- cGAS /結合蛋白/靶基因 對LT-HSCs靜息狀態和免疫的調控

最后就是調控通路回到細胞表型上，通過回復性試驗進行驗證。聯合敲除Cia-Cgas/和結合蛋白后，實驗方法跟功能研究實驗一樣。

7.Cia- cGAS作用機制圖