p53突變型腫瘤通過外泌體miR-1246將巨噬細(xì)胞重編程為支持腫瘤生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞
Mutant p53 cancers reprogram macrophages to tumor supporting macrophages via exosomal miR-1246
p53突變型腫瘤通過外泌體miR-1246將巨噬細(xì)胞重編程為支持腫瘤生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞
TP53突變體（mutp53）參與大多數(shù)人類癌癥的發(fā)病進(jìn)程。特定的mutp53蛋白獲得與野生型蛋白的腫瘤抑制活性不同的致癌功能。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages, TAMs）是實(shí)體瘤的標(biāo)志，通常與不良預(yù)后相關(guān)。來自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的Curtis C. Harris團(tuán)隊(duì)近期在《Nature communications》（IF=12.124）上發(fā)表論文報(bào)告了人類mutp53癌細(xì)胞將巨噬細(xì)胞重編程為腫瘤支持性和抗炎狀態(tài)巨噬細(xì)胞的非細(xì)胞自主機(jī)制。攜帶致癌活性mutp53的結(jié)腸癌細(xì)胞選擇性地釋放富含miR-1246的外泌體。相鄰巨噬細(xì)胞攝取這些外泌體后觸發(fā)miR-1246依賴的重編程將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌癥促進(jìn)狀態(tài)的巨噬細(xì)胞。Mutp53重編程 TAMs有利于抗炎免疫抑制且TGF-β活性增加。這些研究結(jié)果提示mutp53在參與免疫系統(tǒng)促進(jìn)癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移微環(huán)境中發(fā)揮致癌作用。
研究結(jié)果
攜帶mutp53的腫瘤細(xì)胞將巨噬細(xì)胞重編程
圖1 攜帶mutp53的癌細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞發(fā)揮非細(xì)胞自主作用。a. 人原代單核細(xì)胞分別在3種不同巨噬細(xì)胞譜系(M0, M1及M2)及具有不同p53突變狀態(tài)的HCT116細(xì)胞中進(jìn)行生長(zhǎng)和分化; b. 人原代單核細(xì)胞如a中培養(yǎng)并與含mutp53的HT29共培養(yǎng); c. 共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞接種于cy-3-明膠覆蓋的載玻片上48小時(shí)，并檢測(cè)明膠降解速率; d. 共培養(yǎng)細(xì)胞采用CD163和CD206熒光抗體染色并通過流式細(xì)胞儀分析; e. 共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞接種在玻片并與熒光酵母聚糖顆粒孵育24小時(shí)后檢測(cè)酵母聚糖吞噬作用；f. g. 共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞收集后通過電阻抗重新接種，5天后檢測(cè)遷移(f)和侵襲(g).
mutp53腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體攜帶特異性的miRNA標(biāo)簽
2. 腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體被相鄰巨噬細(xì)胞攝取. a. 從含野生型、突變型或敲除型p53的HCT116細(xì)胞中分離外泌體并通過Western blot鑒定；b.外泌體粒徑檢測(cè)；c. 外泌體濃度檢測(cè)；d. 在與巨噬細(xì)胞孵育24或48小時(shí)前，使用syto RNA標(biāo)記外泌體，采用延時(shí)電影捕獲外泌體攝取積累。e. 外泌體提取RNA，并檢測(cè)RNA完整性及質(zhì)量，并歸一化為豐度最高的100個(gè)miRNAs. f. mutp53型HT29細(xì)胞與對(duì)照相比變化倍數(shù)超過2倍的miRNAs. g. 4種主要miRNAs的變化倍數(shù).
外泌體miR-1246與腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的mutp53相關(guān)
3 mutp53腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體攜帶特定的miRNA. a.巨噬細(xì)胞與HCT116細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)miR-1246; b. 巨噬細(xì)胞與含不同p53突變狀態(tài)的HCT116細(xì)胞分離的外泌體(10μg)共培養(yǎng)，檢測(cè)miR-1246, miR-21及miR-4454; c. M1及M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染LNA-miR-1246 mimic或?qū)φ蘸髾z測(cè)TNF-α 和 IL-10. d. HCT116 mutp53細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic，miR-1246 inhibitor或?qū)φ? 48小時(shí)后，與M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)3天并檢測(cè)TNF-α, CCL2及IL-10. e. HCT116 mutp53細(xì)胞分離外泌體并通過不同尺寸柱子分離游離蛋白。巨噬細(xì)胞與外泌體(exos)或游離蛋白(Prot)孵育并檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量; f. M2巨噬細(xì)胞與不同狀態(tài)p53的HCT116外泌體共培養(yǎng)不同時(shí)間后檢測(cè)pre-miR-1246.
Mutp53觸發(fā)miR-1246依賴性的巨噬細(xì)胞重編程
4. miR-1246與mutp53相關(guān)且在重編程腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中發(fā)揮作用. a.b. M2巨噬細(xì)胞與mutp53或野生型p53 HCT116細(xì)胞共培養(yǎng)6天，將重編程巨噬細(xì)胞與HCT116野生型細(xì)胞混勻后接種到NOD-SCID小鼠上，每周觀測(cè)腫瘤大小. c.d. 在第56天，處死小鼠，取出肝和肺檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶；e.f. M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic 及空載，3天后，將巨噬細(xì)胞與熒光標(biāo)記的HCT116細(xì)胞混合并皮下注射到NOD-SCID小鼠后背.
5. Mutp53與結(jié)直腸癌患者腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)
5 Mutp53與結(jié)直腸癌患者的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞正相關(guān). a.b. 與攜帶野生型p53的結(jié)直腸癌患者相比，攜帶mutp53人結(jié)直腸癌患者的癌腺體上皮細(xì)胞中p53呈強(qiáng)陽(yáng)性免疫染色且與周圍基質(zhì)細(xì)胞中CD163和CD206呈相關(guān)性. c.d. 與野生型p53病例相比，攜帶mutp53結(jié)直腸癌患者的侵襲前沿中呈現(xiàn)彌散且強(qiáng)烈的CD206免疫陽(yáng)性. e. mRNA表達(dá)譜分析. f. 攜帶不同p53的結(jié)直腸癌患者的生存曲線分析.
6. Mutp53與結(jié)直腸癌患者的miR-1246正相關(guān)
6 Mutp53與結(jié)直腸癌患者miR-1246呈相關(guān)性. a. 27例野生型p53的結(jié)直腸癌患者和28例mutp53患者的miRNA芯片. b. 與野生型P53病例相比，攜帶mutp53患者的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞呈miR-1246強(qiáng)陽(yáng)性染色. d. 結(jié)直腸癌患者外泌體miRNA檢測(cè).
7. 結(jié)直腸癌患者TGF-β信號(hào)通路和免疫抑制
7 攜帶mutp53的結(jié)直腸癌患者TGF-β信號(hào)通路和免疫抑制增加. a.b. 與野生型p53結(jié)腸癌患者相比，攜帶mutp53的結(jié)直腸癌患者呈現(xiàn)p53強(qiáng)陽(yáng)性上皮細(xì)胞染色，且與FOXP3非上皮細(xì)胞免疫染色相關(guān). c.d. GSEA分析p53獲得性突變結(jié)腸癌細(xì)胞與其他突變類型結(jié)腸癌細(xì)胞的炎性基因集合與TGF-β信號(hào)通路基因集合. e. 假說圖.
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