環狀RNA是高度穩定的調控RNA，與腫瘤發生和進展的關系日益密切。然而，許多環狀RNA在三陰性乳腺癌(TNBC)中的作用及其相關機制尚未闡明。TNBC中circRPPH1的上調與不良預后呈正相關。此外，在體內和體外，circRPPH1都促進了TNBC細胞的生物學惡性行為。此外，circRPPH1可能作為miR-326的分子海綿，控制ITGA5的表達，激活FAK/PI3K/AKT通路。我們的研究表明，ZNF460可以促進circRPPH1的表達，circRPPH1/miR326/ITGA5軸可以激活FAK/PI3K/AKT通路，促進TNBC的進展。因此，circRPPH1可作為TNBC的治療或診斷靶點。本文于2024年2月發表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。

技術路線

結果：

1）circRPPH1的鑒定及臨床特征

         我們通過檢查來自GSE101123數據集的TNBC組織和正常乳腺組織的RNA測序陣列，篩選出了20個表達變化最顯著的circRNAs。在鑒定的circRNAs中，hsa_circRNA_000166與TNBC之間的關系尚不清楚。本文將重點研究其在TNBC中的生物學活性及其相關機制。Hsa_circRNA_000166(本研究中簡稱circRPPH1)是由RPPH1基因編碼的mRNA通過反向剪接產生的，Sanger測序證實了其反向剪接位點的存在(圖1A)。然后，我們通過qRT-PCR驗證，與MCF10A細胞相比，SUM1315和MDA-MB-231細胞中的circRPPH1表達明顯上調(圖1B)。為了驗證circRPPH1是一個環狀的頭尾連接，我們從TNBC細胞中提取cDNA和gDNA，然后使用收斂引物和發散引物進行PCR擴增。結果表明，circRPPH1可以利用發散引物從cDNA擴增。這表明circRPPH1是一個環狀結構，是由頭尾連接的轉錄后剪切產生的(圖1C)。RNase R分析表明，circRPPH1比親本基因和GAPDH表現出更高的降解抗性。這表明circRPPH1是一種比線性RNA更穩定的環狀RNA(圖1D和E)。核細胞質分離和FISH檢測顯示circRPPH1主要存在于細胞質中，平均熒光強度顯示TNBC組織比正常乳腺組織表達更多的circRPPH1(圖1F-H)。為了探索circRPPH1的應用價值，我們檢測到TNBC組織中circRPPH1的表達增加(圖1I)。ROC曲線顯示，特異性為0.8，敏感性為0.567，曲線下面積為0.705(圖1J)。我們隨后根據TNBC患者隨訪數據繪制了Kaplan-Meier生存曲線，結果顯示circRPPH1高表達患者的總生存期比circRPPH1低表達患者短(圖1K)。根據這些發現，circRPPH1可以用于診斷和預后。

2）ZNF460增加了RPPH1和circRPPH1的表達

         為了探究是否存在影響RPPH1和circRPPH1表達的轉錄因子，我們通過NCBI查找了RPPH1啟動子可能的序列，發現了3個轉錄因子ZNF460與RPPH1啟動子的結合位點。我們假設ZNF460可能影響RPPH1表達的轉錄調控。為了進一步研究ZNF460的作用，我們設計了ZNF460過表達載體(pcDNA3.1-ZNF460)、敲低載體(sh1-ZNF460、sh2-ZNF460、sh3-ZNF460)和相應的陰性對照載體，并通過qRT-PCR驗證了它們的有效表達(圖2A和B)。轉染sh1-ZNF460后，RPPH1在TNBC細胞中的表達顯著降低。但轉染過表達載體pcDNA3.1-ZNF460后，RPPH1在TNBC細胞中的表達顯著升高(圖2C和D)。根據ZNF460與RPPH1啟動子的結合序列，我們構建了帶有野生型或突變型RPPH1啟動子序列的熒光素酶報告質粒(圖2E和F)。研究結果顯示，ZNF460增強了野生型RPPH1啟動子質粒的熒光素酶活性，而突變型質粒則保持不變(圖2G和H)。ChIP-qPCR實驗顯示，與陰性對照IgG相比，ZNF460與RPPH1啟動子結合(圖2I)。最后，我們通過RT-qPCR驗證，轉染pcDNA3.1-ZNF460后，TNBC細胞內circRPPH1表達升高，而轉染sh1-ZNF460后，circRPPH1表達降低(圖2J)。根據上述發現，ZNF460可能附著在RPPH1啟動子區域，從而調控其和circRPPH1的表達。

3）CircRPPH1促進TNBC細胞生長、遷移和侵襲

         我們通過集落形成實驗、EdU和CCK-8實驗驗證了circRPPH1的敲低抑制了TNBC細胞的增殖，而circRPPH1的過表達促進了細胞增殖(圖3A-D)。此外，Transwell和傷口愈合實驗表明，干擾circRPPH1可降低TNBC細胞的遷移和侵襲能力，而過表達circRPPH1則相反(圖3E和F)。根據上述發現，circRPPH1在TNBC細胞中發揮了促癌作用。

4）CircRPPH1促進TNBC細胞EMT，調節細胞周期，抑制細胞凋亡

         考慮到EMT機制也有助于腫瘤細胞轉移，我們利用免疫熒光法來確定相關蛋白的水平。我們的研究結果顯示，沉默circRPPH1后，TNBC細胞中E-cadherin表達增加，而N-cadherin和vimentin表達減少(圖4A)。Western blot實驗結果與IF實驗結果一致(圖4B)。接下來，我們使用流式細胞術檢測細胞周期，我們的數據顯示，沉默circRPPH1后，TNBC細胞處于G1期的比例增加，處于S期的比例減少(圖4C)。我們還通過Western blot檢測到沉默circRPPH1后細胞周期相關蛋白的表達減少(圖4D)。這表明沉默circRPPH1后細胞周期被阻斷。之后，我們進行Annexin V/PI染色流式細胞術研究，發現敲低circRPPH1顯著提高了細胞的早期凋亡率(圖4E)。同樣，我們使用Western blot發現，敲低circRPPH1后，Bcl-2表達降低，而cleaved caspase-3和Bax表達升高(圖4F)。此外，免疫熒光實驗顯示，敲低circRPPH1后caspase-3表達增加(圖4G)。綜上所述，circRPPH1在TNBC細胞中具有促進EMT、加速細胞周期、抑制細胞凋亡的生物學功能。

5）CircRPPH1通過直接結合miR-326起到分子海綿的作用

         為了進一步了解circRPPH1在TNBC中的功能，我們使用ENCORI數據庫和CircInteractome數據庫預測hsa-miR-330-5p和hsa-miR-326可能與circRPPH1相互作用(圖5A)。我們檢測到TNBC細胞中miR-326和miR-330-5p表達下調和上調(圖5B)。同樣，miR-326在TNBC組織中的表達明顯降低(圖5C)。根據Kaplan-Meier生存分析(圖5D)，miR-326表達較高的患者總生存時間也更長。通過Pearson相關分析，我們發現TNBC組織中circRPPH1的表達水平與hsa-miR-326呈負相關(圖5E)。因此，我們預測circRPPH1可以在TNBC中與miR-326結合，從而發揮分子海綿的作用。我們驗證了circRPPH1敲低或過表達對miR-326表達的影響。結果表明，circRPPH1過表達會降低miR-326的表達，而circRPPH1敲低則會產生相反的效果(圖5F和G)。根據ENCORI數據庫的circMIR軟件，我們根據circRPPH1與miR-326結合得分最高的區域，創建了具有野生型和突變型circRPPH1序列的雙熒光素酶報告質粒。miR-326模擬物降低野生型質粒的熒光素酶活性(圖5H和圖I)。根據FISH檢測(圖5J和K)，CircRPPH1和miR-326主要存在于細胞質中。此外，我們使用生物素標記的circRPPH1探針在TNBC細胞中進行了RNA pull-down實驗，結果顯示生物素標記的circRPPH1探針組中circRPPH1和miR-326的富集量大幅增加(圖5L和M)。綜上所述，circRPPH1可能起到分子海綿的作用，直接與miR-326結合。

6）MiR-326部分逆轉了circRPPH1的促腫瘤作用

         為了進一步了解miR-326和circRPPH1如何相互作用，我們使用miR-326模擬物或抑制物與si-circ或過表達載體circRPPH1進行了拯救實驗。集落形成、EdU和CCK-8檢測表明，miR-326模擬物阻斷了circRPPH1過表達對TNBC細胞生長的影響，而miR-326抑制劑恢復了circRPPH1敲低對TNBC細胞增殖的影響(圖6A-E)。此外，關于miR-326對TNBC細胞侵襲和遷移的影響，我們發現miR-326模擬物可以抑制過表達circRPPH1對其的促進作用，而miR326抑制劑可以部分逆轉敲低circRPPH1對其的抑制作用(圖6F-I)。上述實驗表明，miR-326作為一種致癌因子，可以抵消circRPPH1的促癌活性。

7）CircRPPH1通過miR-326/ITGA5軸刺激FAK/PI3K/AKT通路

         為了完善circRPPH1/miR-326軸并探索其下游調控機制，我們利用miRTarBase數據庫、miRBD數據庫和TargetScan數據庫預測ITGA5可能是miR-326的下游基因。通過Western blot和qRT-PCR，我們能夠證明miR-326模擬轉染SUM1315細胞和MDA-MB-231細胞可降低ITGA5的表達而當使用miR-326抑制劑時，ITGA5的表達增加(圖7A和B)。為了證實ITGA5和miR-326之間的相互作用，我們創建了具有野生型和突變型ITGA5 3 ' UTR的雙熒光素酶報告質粒。根據研究結果，轉染miR326模擬物顯著降低了野生型質粒的熒光素酶活性，但對突變型質粒沒有顯著影響(圖7C和D)。我們隨后證實ITGA5在TNBC組織中上調(圖7E)。Pearson相關研究顯示circRPPH1與ITGA5呈正相關，但miR-326與ITGA5表達水平呈負相關(圖7F)。然后，我們在敲低或過表達circRPPH1后檢測ITGA5的表達。研究結果表明，circRPPH1過表達可改善ITGA5的表達，而敲低后結果則相反(圖7G)。隨后，我們通過拯救實驗發現，miR-326模擬物或抑制劑可以撤銷circRPPH1過表達或敲低導致的ITGA5表達的改變(圖7H)。根據KEGG通路分析，ITGA5是PI3K/AKT通路的相關基因。因此，我們分析了TNBC細胞中circRPPH1上調或下調后ITGA5及其下游基因的表達情況。在TNBC細胞系中，我們發現過表達circRPPH1可顯著增加ITGA5、p-FAK、p-PI3K和p-AKT的表達，而轉染si-circRPPH1則具有相反的效果。此外，miR-326模擬物或抑制劑可能會抵消這些作用(圖7I-K)。這些發現表明，miR-326/ITGA5軸介導的circRPPH1激活FAK/ PI3K/AKT通路可促進TNBC細胞的侵襲性。

8）CircRPPH1促進TNBC細胞在體內的生長和轉移

         我們構建了穩定敲低或過表達circRPPH1的TNBC細胞系，以驗證circRPPH1在體內的生物學功能。然后，我們將上述細胞系皮下注射到裸鼠體內，觀察腫瘤的生長和大小。與對照組相比，circRPPH1敲低組的腫瘤大小和重量顯著減小，而過表達circRPPH1后結果相反(圖8A-C)。我們將感染熒光素酶質粒的TNBC細胞注射到裸鼠尾靜脈，研究circRPPH1對轉移的影響。生物發光成像和H&E染色分析顯示，circRPPH1敲低后，肺轉移灶的數量和大小顯著減少，而circRPPH1過表達的影響則相反(圖8D-G)。以上結果提示，在體內，circRPPH1誘導ITGA5促進TNBC細胞生長和轉移。

結論：

         我們發現了一種名為circRPPH1的新circRNA，它在TNBC中過表達，預示著預后不良。機制上，circRPPH1可以結合miR-326控制ITGA5的表達，激活FAK/PI3K/AKT通路，導致TNBC的發展。因此，circRPPH1可能為TNBC提供有用的診斷工具和潛在的治療靶點。

實驗方法：

         qRT-PCR，Western blot，FISH，雙熒光素酶報告分析，EdU，CCK-8，

參考文獻：

         Zhang C, Yu Z, Yang S, Liu Y, Song J, Mao J, Li M, Zhao Y. ZNF460-mediated circRPPH1 promotes TNBC progression through ITGA5-induced FAK/PI3K/AKT activation in a ceRNA manner. Mol Cancer. 2024 Feb 14;23(1):33. doi: 10.1186/s12943-024-01944-w.