膽管癌（Colangiocarcinoma，CCA）是一種起源于膽管的高度致命的惡性腫瘤。目前的 CCA 診斷和預后評估無法滿足臨床需求。膽汁檢測很少進行，在此，作者旨在通過評估膽汁外泌體的濃度和成分來估計膽汁液體活檢的臨床意義。CCA 細胞將外泌體miR-182/183-5p 分泌到膽汁中，而miR-182/183-5p 可靶向 CCA 細胞和 MCs 中的羥基前列腺素脫氫酶，增加前列腺素 E2和血管內皮生長因子-A 的釋放。前列腺素 E2 通過激活 PTGER1促進干性。該研究于2024年2月發表在《Hepatology》，IF：13.5。

技術路線：

主要研究結果：

1. 膽汁外泌體miR-182-5p和miR-183-5p是CCA的生物標志物

從44例膽總管結石（CBDS）患者、6例胰腺癌患者和121例CCA患者的膽汁和血清中，采用超速離心法提取外泌體，并通過透射電鏡、生物標志物檢測、納米顆粒跟蹤分析和NanoFCM進行鑒定(圖1A)。有趣的是，CBDS、PDAC和CCA患者的膽汁外泌體（Exo）濃度沒有顯著差異，但CCA患者的血清Exo明顯多于其他患者(圖1B)。此外，根據Exo濃度將隊列分為Exohigh和Exolow亞群，膽汁Exo濃度是比血清Exo濃度敏感得多的生物標志物(圖1C)。提取膽汁或血清外泌體，孵育CCA細胞。有趣的是，膽汁而非血清Exos顯著促進CCA細胞增殖和侵襲(圖1D)。利用液相色譜串聯質譜和miRNA-seq技術研究CCA和CBDS的膽汁Exos的含量)。在pCCAs/dCCAs的miRNA-seq中，癌旁組織、CCA膽汁和血清Exos共有3個上調的miRNA，分別為miR-182-5p、miR-183-5p和miR-221-3p(圖1E)。有趣的是，miR-182-5p和miR183-5p屬于同一個miRNA簇。在CCA血清Exo miRNA-seq的多個數據集中驗證miR-182- 5p和miR-183-5p的上調，而不是miR-221-3p的上調(圖1E)。檢測CCA、PDAC、CBDS、HCC、原發性硬化性膽管炎和膽總管囊腫的膽汁和血清中的外泌體miR-182/183-5p，表明外泌體miR-182/183-5p的顯著增加在CCA中是特異性的(圖1F)。

圖1. 外泌體miR-182-5p和miR-183-5p在CCA膽汁中上調

2. 膽汁外泌體miR-182-5p和miR-183-5p參與Exo誘導的CCA進展

通過將miR-182/183-5p模擬物電轉染到CBDS膽汁的Exos中來制備人工過表達miR-182/183-5p的Exos，通過將miRNA抑制劑電轉染到CCA膽汁的Exos中來制備miR-182/183-5p沉默的Exos (圖2A)。使用經過改造的Exos孵育CCA細胞，結果表明，miR-182/183-5p過表達增加了膽汁Exos誘導的增殖、侵襲和EMT，而miR-182/183-5p抑制劑減弱了其誘導的增殖、侵襲和EMT(圖2B-D)。利用QBC-939細胞建立異種移植瘤模型，瘤內注射過表達或沉默mir-182/183-5p的Exos。CCBDS-膽汁Exos對腫瘤生長無顯著影響，但如果將這些Exos轉染miR-182/183-5p模擬物，則腫瘤體積和重量顯著增加(圖2E)。這些實驗表明，miR-182/183-5p是膽汁Exos誘導的CCA進展的重要參與者。

臨床上，根據膽汁/血清外泌體miR-182/183-5p水平將患者分為miR-182/183-5phigh和miR-182/183-5plow亞群，并提示膽汁外泌體miR-182/183-5p與血清Exo中的miR-182/183-5p相比是更敏感的預后生物標志物(圖2F)。

圖2. 膽汁外泌體miR-182-5p和miR-183-5p參與外泌體誘導的CCA進展

3. 含有miR-182/183-5p的外泌體由CCA衍生并通過自分泌途徑促進疾病進展

為了研究含miR-182/183-5p的Exos的來源，使用透射電子顯微鏡和nanoFCM從CCA細胞系中提取并鑒定Exos(圖3A)。使用PKH26標記的CCA膽汁Exos或轉染cy3標記的miR-182-5p和FAM標記的miR-183-5p的CCA膽汁Exos孵養類器官或CCA細胞，表明膽汁Exos和CCA來源的miR182/183-5p均可被類器官和細胞吸收(圖3B和C)。將PHK26標記的膽汁Exos或電轉染cy3-miR-182- 5p/FAM-miR-183-5p的膽汁Exos注射到皮下CCA異種移植物中。PKH26標記的膽汁Exos可以在CCA組織中廣泛觀察到(圖3D)。裸miR182/183-5p不能被CCA腫瘤吸收，但外泌體miR-182/183-5p能夠被異種移植物吸收(圖3D)，提示miR-182/183-5p可以通過外泌體的方式被CCA組織吸收。此外，將負載cy3/ FAM標記的miR182/183-5p的膽汁Exos注射到小鼠膽囊中，建立原位模型，并檢測膽管上皮對miRNA的攝取。與圖3D的結果一致，膽管上皮細胞可獲取外泌體miR-182/183-5p，但不能獲取裸miRNA(圖3E)。所有結果表明，miR-182/183-5p可從CCA細胞釋放并被其他CCA細胞或上皮細胞吸收。此外，與對照細胞培養基相比，miR-182/183-5p過表達細胞培養基中的Exos廣泛促進了CCA的增殖、侵襲和EMT(圖3F)。

圖3.CCA來源的miR-182/183-5p可通過外泌體方式被CCA細胞吸收

4. 細胞內miR-182/183-5p促進CCA增殖、侵襲和EMT

在瞬時轉染miR182/183-5p模擬物或抑制劑或穩定過表達miR-182/183-5p的CCA細胞中，過表達miR-182/183-5p時觀察到促進了增殖、遷移、侵襲和EMT，而沉默miR-182/183-5p時則發生了相反的作用(圖4A-C)。在體內實驗中，使用對照細胞或穩定的miR-182/183-5過表達QBC-939的皮下異種移植也表明，miR-182/183-5p促進CCA生長(圖4D)。通過尾靜脈注射穩定過表達miR-182/183-5p的QBC-939細胞建立轉移模型，提示miR-182/183-5p過表達促進腫瘤轉移(圖4E)。以上結果表明，細胞內miR-182/183-5p可促進CCA進展。

5. 膽管癌組織和膽汁Exos中miR-182/183-5p與膽管癌預后相關

通過原位雜交發現miR-182/183-5p在CCA中的表達顯著高于癌旁組織，并且CCA組織中的miR-182/183-5p表達與膽汁和血清的外泌體miR-182/183-5p顯著相關(圖4F)。以CCA miR182/183-5p為界值，將患者分為CCA miR182/183-5p低表達組和CCA miR182/183-5p高表達組。CCA組織中高miR-182/183-5p與所有CCA亞型的不良預后顯著相關(圖4F)。 

圖4. 細胞內miR-182/183-5p促進CCA的進展，并與CCA的預后相關

6.HPGD是miR-182/183-5p的靶基因，在膽管癌中通過升高前列腺素E2促進腫瘤干性

miR-182/183-5p過表達QBC939的mRNA-seq篩選miR-182/183-5p的靶基因，發現miR-182-5p和miR-183-5p共同下調的基因有127個(GSE:214159)。結合miRNA數據庫(miRPathDB和miRWalk)預測的2606個靶基因，進一步篩選出5個基因作為miR-182/183-5p的候選靶基因，分別為TIGAR、AKR1CA、HPGD、SH3BP5和KLHL8，其中HPGD被實時熒光定量PCR驗證為下調最明顯的基因(圖5A)。在CCA細胞中，miR-182/183-5p模擬物顯著降低HPGD的表達(圖5A)，雙熒光素酶報告基因實驗進一步鑒定HPGD mRNA 3'UTR的miR-182/183-5p結合序列(圖5B)。在CCA細胞中，過表達miR-182/183- 5p或HPGD抑制劑SW022391增加了細胞內和培養基中的PGE2(圖5C)。更有趣的是，CCA膽汁中的PGE2顯著高于CBDS膽汁中的PGE2，但血清中的PGE2沒有顯著差異(圖5C)。PGE2濃度與膽汁外泌體miR-182/183-5p呈正相關，但與血清外泌體miR-182/183-5p無相關性(圖5D)。通過時序檢驗進一步確定HPGD是CCA預后良好的生物標志物(圖5E)。COX1/2是PGE2生成的關鍵酶，使用HPGD抑制劑SW033291和COX1/2抑制劑氯諾昔康處理miR-182/183-5p過表達/沉默和HPGD過表達/沉默細胞，以驗證HPGD是否為miR-182/183-5p誘導的疾病進展的責任基因。敲低HPGD后細胞增殖和侵襲能力增強，而過表達HPGD后細胞增殖和侵襲能力減弱。此外，miR-182/183-5誘導的CCA進程被SW033291增強，而被氯諾昔康減弱。外源性二甲基pge2 (dmPGE2)在一定程度上恢復HPGD過表達引起的抑制(圖5F)。這些結果表明HPGD在miR-182/183-5p誘導的CCA進展中是必需的。外源性PGE2挽救HPGD過表達和miR-182/183-5p抑制劑引起的腫瘤抑制作用(圖5F)。上述結果表明，miR-182/183-5p通過抑制HPGD的表達促進CCA的干性，進而促進細胞增殖、遷移和侵襲，從而產生更多的PGE2。。

圖5. miR-182/183-5p通過靶向HPGD并上調PGE2促進腫瘤干性

7. miR-182/183-5p-HPGD軸通過促進肥大細胞釋放VEGF-A來促進血管生成

對8例肝外膽管癌和3例癌旁組織進行單細胞mRNA-seq (GSE:213452)，并將數據與之前發表的iCCA單細胞mRNA數據(GSE:138709)整合。在整合的數據中，肥大細胞(MC)的HPGD表達明顯高于其他細胞類型(圖6A)，因此進一步評估HPGD在MC中的功能。PKH26標記的膽汁外泌體和Cy3/ FAM標記的CCA細胞來源的外泌體均與MC細胞系LAD2孵育。與CCA細胞一樣，LAD2可以吸收膽道或CCA來源的外泌體miR182/183-5p(圖6B)。應用Olink蛋白質組學(Immuno-Oncology panel)和非標記質譜技術篩選miR182/183-5p是否促進MCs釋放其他腫瘤相關因子。在Olink中，VEGF-A是在HPGD沉默的MCs培養基和mir -182/183-5p過表達的MCs培養基中上調最顯著的蛋白(圖6C )。在label-free質譜分析中，25種蛋白質在miR-182/183-5p過表達和HPGD沉默的MC培養基中同時增加，VEGF-A是已知的唯一從MC釋放的蛋白質(圖6D)。VEGF-A是眾所周知的血管生成因子，因此進一步用管形成實驗檢測CCA的血管生成。過表達miR-182/183-5p或沉默HPGD-LAD2的條件培養基分別與VEGF-A中和抗體Bevacizumab孵育人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)。貝伐珠單抗顯著阻斷由miR-182/183-5p過表達或HPGD沉默的LAD2條件培養基誘導的血管生成(圖6E)。

此外，在HSC-NOGEXL小鼠中建立pCCA PDXs來模擬CCA腫瘤微環境(TME)，并注射Figure 2A所示的Exos。將貝伐單抗、氯諾昔康或載氯諾昔康的水凝膠注射到腫瘤內。貝伐珠單抗和氯諾昔康可廣泛抑制腫瘤生長，而攜帶氯諾昔康的水凝膠由于氯諾昔康持續釋放，因此具有更強的腫瘤抑制作用(圖6F)。作為血管生成的指標，注射miR-182/183- 5p過表達的CBDS-Exo后，PDXs中的MVD增加，如果給予貝伐珠單抗或氯諾昔康，則減少(圖6G)。上述結果表明，miR182/183-5p可通過誘導MC分泌PGE2和VEGF-A促進CCA進展。

圖6. MC中miR-182/183-5p-HPGD軸通過重塑CCA微環境促進血管生成

8.PGE2通過激活PTGER1促進CCA干性

TGER1的表達主要在CCA組織和細胞系中，而PTGER4的表達主要在癌旁組織中(圖7A和B)。通過分別沉默PTGER1-4，我們發現PTGER1敲低顯著降低了dmPGE2誘導的干性，因此減弱了CCA的增殖和侵襲(圖7C)。此外，miR-182/183-5p過表達或HPGD敲低對CCA干性、增殖和侵襲的促進作用可被PTGER1敲低所阻斷，表明在miR-182/183-5p-HPGD-PGE2軸參與的CCA進展中，PTGER1是必需的(圖7D)。通過Bret實驗，證明在QBC-939細胞中PTGER1與Gαq偶聯(圖7E)。此外，用dmPGE2和Gαq拮抗劑YM-254890處理ptger1沉默的QBC-939細胞，檢測到Gαq-PLC-PKC信號通路下游生物標志物MARCKS的磷酸化，進一步提示CCA細胞中PGE2偶聯PTGER1-Gαq-PLC-PKC信號通路(圖7F)。

PGE2通過激活PTGER1促進CCA干性

結論

綜上所述，本研究通過體外/體內實驗和患者來源的異種移植(PDX)實驗，確定miR-182/183-5p的靶基因，并闡明了外泌體miR-182/183-5p誘導CCA進展的機制，揭示了一種依賴于膽汁外泌體 miR-182/183-5p 和 MCs 的CCA自我驅動進展類型，這是 CCA 與膽汁相互作用的一種新模式。

實驗方法：

膽汁和血清的獲取，外泌體分離，移植瘤模型構建，細胞培養和處理，細胞轉染，原位雜交，雙熒光素酶報告基因實驗，時序檢驗，單細胞mRNA-seq，質譜分析，管形成實驗檢測，Bret實驗，RT-PCR和qRT-PCR

參考文獻

Shu L, Li X, Liu Z, Li K, Shi A, Tang Y, Zhao L, Huang L, Zhang Z, Zhang D, Huang S, Lian S, Sheng G, Yan Z, Zhang Z, Xu Y. Bile exosomal miR-182/183-5p increases cholangiocarcinoma stemness and progression by targeting HPGD and increasing PGE2 generation. Hepatology. 2024 Feb 1;79(2):307-322. doi: 10.1097/HEP.0000000000000437. Epub 2023 May 5. PMID: 37140231.