據報道，circRNAs在許多癌癥的進展中發揮重要作用。然而，circRNA在肝內膽管癌(ICC)中的功能尚不清楚。circPCNXL2在ICC組織和細胞系中表達上調，促進ICC體外和體內的增殖和轉移。從機制上看，circPCNXL2可以直接結合到STRAP上，誘導STRAP與MEK1/2相互作用，通過激活ERK/MAPK通路，促進ICC的腫瘤發展。此外，circPCNXL2可以通過海綿化miR-766-3p調控SRSF1的表達，從而促進ICC的生長。最后，circPCNXL2在體內可以部分抑制曲美替尼的抗腫瘤活性?？傊?，circPCNXL2通過與STRAP相互作用激活ERK信號通路，以及調節miR-766-3p/SRSF1軸，在ICC的進展中發揮了至關重要的作用。這些發現表明circPCNXL2可能是一種有希望的ICC生物標志物和治療靶點。本文于2024年2月發表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。

技術路線

結果：

1）circPCNXL2在ICC中上調

         為了評估circRNAs在ICC中的作用，我們分析了來自7個ICC及其鄰近組織的RNA-seq數據。我們發現ICC中89個circRNA表達上調，67個circRNA表達下調。has_circ_0016956 (circPCNXL2)是上調最多的circRNA之一，通過qRT-PCR在我們的76對ICC組織中證實了其過表達(圖1a-c)。高circPCNXL2組的患者表現出較差的總生存期(OS)(圖1d)。circPCNXL2在4種ICC細胞系中的表達也較高，我們選擇了HuCCT1和RBE細胞進行后續研究(圖1e)。為了確認circPCNXL2的環狀結構，我們對qRT-PCR產物進行Sanger測序，確認其首尾反向剪接(圖1f)。我們只發現circPCNXL2通過發散引物從cDNA中擴增出來(圖1g)。經RNase R和放線菌素D處理后，我們觀察到circPCNXL2比線性PCNXL2表現出更大的穩定性(圖1h-i)。這些結果證明了circPCNXL2的環狀特性。通過熒光原位雜交(FISH)和細胞質及細胞核RNA純化分析，circPCNXL2轉錄物主要存在于HuCCT1和RBE的細胞質中(圖1j-l)。上述發現提示circPCNXL2在ICC組織中過表達，且主要位于ICC細胞的細胞質中。

2）CircPCNXL2在體外促進ICC的增殖和遷移

         為了闡明circPCNXL2在ICC中的生物學功能，我們利用靶向剪接連接的siRNA敲低circPCNXL2的表達，并合成circPCNXL2質粒過表達circPCXNL2。通過qRT-PCR驗證siRNA和質粒的效率(圖2a-b)。首先，通過CCK-8、EdU和克隆形成實驗檢測circPCNXL2對細胞增殖的影響。結果表明，敲低circPCNXL2抑制了HuCCT1和RBE細胞的增殖。相反，在circPCNXL2過表達組中發現了相反的效果(圖2c-f)。與此一致的是，通過transwell實驗和傷口愈合實驗，circPCNXL2敲低會阻礙遷移能力，而過表達circPCNXL2則會促進遷移能力(圖2g-j)。這些發現表明circPCNXL2在ICC細胞中的致癌作用。

3）CircPCNXL2在體內促進ICC的腫瘤生長和轉移

         為了闡明circPCNXL2對體內ICC的影響，我們構建異種移植瘤模型。circPCNXL2敲低的腫瘤體積較小，而circPCNXL2過表達的RBE細胞的腫瘤生長速度比對照組快(圖3a-f)。免疫組化染色觀察到circPCNXL2敲低組的Ki-67水平較弱。相反，circPCNXL2過表達導致Ki-67染色更強，提示Ki-67與circPCNXL2表達水平之間存在相關性(圖3g-h)。然后，我們構建肝轉移模型，研究circPCNXL2在ICC體內的轉移特征。結果表明，注射敲低circPCNXL2的HuCCT1細胞后，小鼠肝臟轉移結節的數量顯著減少。并且，circPCNXL2過表達增強了肝臟播散能力(圖3i-k)。這些發現表明circPCNXL2促進了體內ICC細胞的轉移。

4）CircPCNXL2調節ICC中ERK/MAPK信號通路的激活

         為了剖析circPCNXL2促進ICC細胞增殖和轉移的潛在機制，我們通過RNA-seq在過表達circPCNXL2的RBE細胞中鑒定了278個差異表達基因(DEGs) (圖4a)。KEGG通路分析顯示，MAPK信號通路是最富集的通路(圖4b)。據報道，MAPK信號通路調節細胞增殖和遷移等關鍵細胞功能?；诖?，我們假設circPCNXL2可能通過MAPK途徑促進ICC的生長和轉移。免疫印跡結果顯示，在HuCCT1和RBE細胞中，circPCNXL2過表達時，MAPK通路中三個亞組的磷酸化水平均增強，而在circPCNXL2敲低組中，磷酸化水平均降低(圖4c)。ERK磷酸化的變化在三個亞組中最為顯著。因此，我們假設circPCNXL2主要通過ERK/MAPK信號通路促進ICC的腫瘤發生。

         為了了解ERK/MAPK通路在circPCNXL2介導的ICC進展中的意義，我們在體外添加了一種高選擇性ERK抑制劑SCH772984來阻斷ERK的磷酸化。我們通過Western Blot驗證了SCH772984能夠有效抑制ERK通路的活性(圖4d-e)。功能上，EdU實驗、CCK8實驗、克隆形成實驗、transwell實驗和傷口愈合實驗表明，circPCNXL2過表達促進了增殖和遷移，而SCH772984可以消除這一作用(圖4f-j)。這些結果共同表明circPCNXL2通過激活ERK/MAPK信號通路促進ICC的生長和遷移。

5）CircPCNXL2與STRAP相互作用介導ERK/MAPK信號通路激活

         為了研究circPCNXL2如何調節ICC中ERK的磷酸化，使用circPCNXL2的生物素化探針在RBE裂解物中進行RNA下拉，然后進行銀染色和質譜分析。然后，我們在大約40 KD處觀察到一個特定的條帶，質譜結果表明STRAP可能能夠與circPCNXL2結合(圖5a-b)。接下來，我們通過RNA下拉和RIP實驗證實了HuCCT1和RBE細胞中circPCNXL2和STRAP之間的相互作用(圖5c-e)。我們通過FISH檢測和免疫熒光證實了circPCNXL2和STRAP的共定位(圖5f)。有趣的是，circPCNXL2敲低或過表達對STRAP的表達沒有影響(圖5g-h)。我們推測circPCNXL2可能在促進ERK激活中起支架作用。據報道，STRAP可以與MEK1/2相互作用，并參與MEK1/2與ERK1/2的相互作用。為了測試在ICC中STRAP是否與MEK1/2相互作用，我們對HuCCT1和RBE進行免疫沉淀和Western Blot檢測。結果表明，MEK1/2被抗STRAP抗體共免疫沉淀，而STRAP也被抗MEK1/2抗體共免疫沉淀。結果表明，在ICC細胞中，STRAP可以與MEK1/2結合(圖5i-j)。然后，為了研究circPCNXL2是否對ICC中STRAP和MEK1/2之間的相互作用有任何影響，我們進行了免疫沉淀實驗。我們觀察到，circPCNXL2過表達可以促進STRAP和MEK1/2之間的關聯，而兩者的蛋白水平沒有變化，相反，circPCNXL2敲低會減弱ICC細胞中STRAP-MEK1/2的相互作用(圖5k-l)。此外，MEK1/2抗體免疫沉淀實驗的進一步結果證實，circPCNXL2也參與ERK1/2-MEK1/2相互作用，并在HuCCT1和RBE細胞中促進ERK1/2的磷酸化(圖5m-n)。此外，為了解剖circPCNXL2和STRAP之間相互作用的精確結合域，設計了一系列flag標記的STRAP缺失突變體，用于RIP和RNA下拉實驗。結果顯示，第4和第5個WD-40結構域負責STRAP與circPCNXL2的結合(圖50-q)。

6）CircPCNXL2通過海綿miR-766-3p上調SRSF1的表達

         據報道，CircRNAs可能以許多其他方式發揮功能，例如編碼功能肽和充當miRNA海綿。然而，在circRNADb中沒有任何假定的開放閱讀框被注釋，這表明circPCNXL2可能無法編碼蛋白質。RIP顯示，在HuCCT1和RBE細胞中， AGO2抗體顯著富集circPCNXL2，這表明circPCNXL2可能在ICC中起miRNA抑制劑的作用。然后，我們通過重疊Targetscan、miRanda和RNAhybrid的miRNA靶標預測，鑒定了4個候選miRNA (miR605-5p、miR-766-3p、miR-4647和miR-6744-5p)(圖6a)。接下來，使用生物素標記的circPCNXL2探針進行RNA下拉實驗，結合潛在的miRNA, miR766-3p是HuCCT1和RBE細胞中富集程度最高的miRNA(圖6b)。RIP檢測結果表明，AGO2抗體富集miR-766-3p(圖6c)。然后我們證實，與正常組織相比，miR-766-3p在ICC組織中下調，并且ICC患者中miR-766-3p的低水平與較差的生存率相關(圖6d-e)。此外，我們觀察到ICC組織中miR-766-3p的表達與circPCNXL2水平呈負相關(圖6f)。我們根據circPCNXL2與miR-766-3p之間的結合區域設計了circPCNXL2的突變質粒，雙熒光素酶報告實驗的結果表明，與對照組相比，共轉染野生型circPNCXL2和miR-766-3p模擬物的熒光素酶活性顯著降低，而突變型circPCNXL2組沒有發現差異(圖6g)。miR-766-3p模擬物顯著抑制HuCCT1細胞的增殖和遷移，miR-766-3p抑制劑促進RBE細胞的ICC進展(圖6h-i)。綜上所述，miR-766-3p可以抑制ICC細胞的腫瘤發生。

         在之前的研究中，miR-766-3p可以通過直接靶向SRSF1抑制腎細胞癌的進展。因此，我們假設SRSF1也可能是ICC中miR-766-3p的下游基因。轉染miR-766-3p模擬物的HuCCT1細胞中SRSF1 mRNA和蛋白水平降低，轉染miR766-3p抑制劑的RBE細胞中SRSF1 mRNA和蛋白水平升高(圖6j-k)。然而，SRSF1在ICC進展中的作用尚不清楚。然后，我們使用qRT-PCR檢測了SRSF1在組織中的表達，發現與正常組織相比，SRSF1在ICC組織中表達上調，而在TCGA數據庫中也觀察到類似的結果(圖6l)。SRSF1的高表達是ICC患者的一個致癌因素(圖6m)。此外，qRT-PCR結果顯示SRSF1表達與circPCNXL2表達呈正相關，而與miR-766-3p的表達呈負相關(圖6n-0)。然后，我們根據SRSF1與miR-766-3p的結合區域設計了SRSF1的突變質粒，雙熒光素酶報告實驗的結果證實了SRSF1與miR-766-3p的相互作用(圖6p)。此外，克隆形成和transwell實驗結果表明，SRSF1過表達顯著促進了HuCCT1細胞的增殖和遷移。在轉染SRSF1下調的RBE細胞中發現了相反的結果(圖6q-r)。我們還證實SRSF1可以促進HuCCT1和RBE細胞中ERK的磷酸化，這可以通過circPCNXL2過表達或敲低來拯救(圖6s-t)。綜上所述，circPCNXL2可以通過miR766-3p/SRSF1/ERK通路調控ICC的增殖和遷移。

7）CircPCNXL2在體內可減輕曲美替尼的抗腫瘤作用

         曲美替尼是一種口服MEK抑制劑，已被批準單獨或聯合用于治療黑色素瘤、非小細胞肺癌等癌癥。為了研究circPCNXL2對曲美替尼的影響，我們在體內應用曲美替尼抑制MEK/ERK通路，并利用circPCNXL2過表達的HuCCT1細胞建立皮下異種移植模型和肝轉移模型。在異種移植物模型中，曲美替尼抑制腫瘤生長，這種抑制作用通過circPCNXL2過表達而恢復(圖7a-c)。免疫組化染色顯示，曲美替尼組Ki-67和p-ERK的染色最弱(圖7d)。circPCNXL2的上調顯著減弱了曲美替尼在ICC中的抗腫瘤作用。在肝轉移模型中也觀察到類似的結果。曲美替尼治療減少了肝轉移灶的數量，可以通過過表達circPCNXL2來恢復(圖7e-f)。綜上所述，這些數據證明circPCNXL2通過激活體內ERK的磷酸化來抑制曲美替尼在ICC中的抗腫瘤作用，這可能是一種很有前景的ICC治療策略。

結論：

         我們的研究表明circPCNXL2在ICC中上調，并通過與STRAP相互作用促進ERK的磷酸化，在ICC的發展中發揮腫瘤啟動子的作用。此外，circPCNXL2作為miR-766-3p的海綿，導致SRSF1的上調，進而激活ICC中的MEK/ERK通路(圖7g)?？偟膩碚f，我們的研究結果表明circPCNXL2可以作為ICC患者的診斷和預后生物標志物。此外，circPCNXL2STRAP-MEK-ERK軸是一個有希望在ICC中進一步研究的翻譯治療靶點。

實驗方法：

         RNA-seq，動物實驗，FISH，RNA pull?down，RIP，免疫共沉淀，雙熒光素酶報告基因實驗，qRT-PCR，WB，IHC，CCK-8，Edu，克隆形成實驗，創傷愈合實驗

參考文獻：

         Liu S, Wang Y, Wang T, Shi K, Fan S, Li C, Chen R, Wang J, Jiang W, Zhang Y, Chen Y, Xu X, Yu Y, Li C, Li X. CircPCNXL2 promotes tumor growth and metastasis by interacting with STRAP to regulate ERK signaling in intrahepatic cholangiocarcinoma. Mol Cancer. 2024 Feb 17;23(1):35. doi: 10.1186/s12943-024-01950-y.