高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSOC）是最致命的婦科惡性腫瘤。它與腫瘤間質(zhì)密切相互作用，生長(zhǎng)迅速，廣泛轉(zhuǎn)移，并表現(xiàn)出侵襲性的過(guò)程。卵巢癌（OC）細(xì)胞停留在腹膜腔內(nèi)，僅播散到間皮襯里表面。目前的標(biāo)準(zhǔn)治療包括細(xì)胞減瘤手術(shù)和化療。然而，大約70%的患者在手術(shù)和鉑類化療后3年內(nèi)復(fù)發(fā)，并死于疾病進(jìn)展。

腫瘤蛋白p53（TP53）基因是人類最常發(fā)生突變的腫瘤抑制基因，多數(shù)通過(guò)點(diǎn)突變，即氨基酸替換導(dǎo)致腫瘤蛋白p53與DNA的結(jié)合中斷。因此，p53通過(guò)對(duì)抗細(xì)胞應(yīng)激和DNA損傷來(lái)保護(hù)人類基因組。許多研究表明，腫瘤細(xì)胞含有功能失活的p53，其作用機(jī)制涉及DNA損傷，從而導(dǎo)致野生型（WT）p53的激活，因此腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物具有耐藥性。癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)揭示，高達(dá)96%的HGSOC病例具有失活或截短的TP53。此外，TP53突變似乎是腫瘤發(fā)生的早期事件，可能在OC的前體病變中，支持TP53突變作為這種惡性腫瘤的驅(qū)動(dòng)因素的重要性。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些小分子來(lái)對(duì)抗p53功能的喪失，主要是通過(guò)穩(wěn)定p53的天然構(gòu)象，如PRIMA-1，它可以重新激活突變的p53，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，目前正在臨床試驗(yàn)中。然而，不同的研究提供了與用于p53再激活的小分子相關(guān)的脫靶效應(yīng)的證據(jù)。因此，是否脫靶活動(dòng)或p53功能的恢復(fù)是治療反應(yīng)的起源目前正在研究中。該研究發(fā)表在《Cancer Communications》，IF：16.2。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. HGSOC細(xì)胞中基于mRNA的p53再激活誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞死亡

作者的目的是通過(guò)用p53 mRNA轉(zhuǎn)染HGSOC細(xì)胞系和原代細(xì)胞來(lái)挽救不同臨床前模型中p53的功能。在OVCAR-8細(xì)胞中，低量的p53-mRNA（10-250 ng）強(qiáng)烈誘導(dǎo)p53蛋白表達(dá)（圖1A）。與對(duì)照組相比，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在100~500 ng p53 mRNA時(shí)，G1期細(xì)胞增加（圖1B），支持p53活性的再激活。在低劑量的p53 mRNA（≥0.1μg）下，細(xì)胞周期抑制因子p21，p16和p27的強(qiáng)烈誘導(dǎo)與關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（如PLK1，Aurora A，CDK1和Cyclin A/B）的下調(diào)相平行，使用基于載體的p53重表達(dá)證實(shí)了作者的結(jié)果（圖1C）。這些觀察結(jié)果與0.5μg劑量的細(xì)胞活力在48小時(shí)后顯著下降約2倍相關(guān)（圖1D），與未處理對(duì)照相比，伴隨著不同細(xì)胞死亡指標(biāo)的上升，如Puma，Noxa和Fas，裂解的PARP，裂解的Caspase-3（圖1C），以及Caspase 3/7活性的增加（圖1E）和膜聯(lián)蛋白染色（圖1F）。克隆形成能力的喪失是通過(guò)增加p53-mRNA的濃度來(lái)誘導(dǎo)的（圖1G）。作者還進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn)，該試驗(yàn)證實(shí)了之前通過(guò)凋亡和集落形成試驗(yàn)觀察到的IVT P53 mRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響（圖1H）。總之，作者的觀察表明，在不同的HGSOC細(xì)胞系中，通過(guò)轉(zhuǎn)染野生型p53 mRNA來(lái)挽救p53功能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

圖1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄的WT p53 mRNA在HGSOC細(xì)胞系OVCAR-8中誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡

2. 在HGSOC細(xì)胞系OVCAR-8中，恢復(fù)p53可降低染色體不穩(wěn)定性

染色體不穩(wěn)定性是OC的基本特征，并且大多數(shù)人OC細(xì)胞表現(xiàn)出非整倍體。OVCAR-8細(xì)胞系是一種超二倍體細(xì)胞系，具有高度的數(shù)值復(fù)雜性和介于50-59的染色體模態(tài)數(shù)。因此，作者的目的是確定恢復(fù)野生型p53的功能是否可以將細(xì)胞中的染色體數(shù)量減少到接近二倍體的狀態(tài)。因此，每隔兩天用低劑量的p53-mRNA處理細(xì)胞，持續(xù)28天，并在孵育期結(jié)束時(shí)評(píng)估染色體的分布（圖2A-B）。當(dāng)野生型p53恢復(fù)后，平均染色體數(shù)目從53減少到47（圖2C-D）。

HGSOC亞型的特征是由多種因素導(dǎo)致的復(fù)制應(yīng)激增加，包括TP53的頻繁缺失。TP53功能的喪失通過(guò)損害DNA損傷反應(yīng)機(jī)制來(lái)促進(jìn)復(fù)制應(yīng)激，這可能部分解釋了在OVCAR-8細(xì)胞中觀察到的遺傳不穩(wěn)定性增加。為了量化p53功能恢復(fù)前后OVCAR-8細(xì)胞中復(fù)制應(yīng)激的程度，作者評(píng)估了Ser139-磷酸化H2AX焦點(diǎn)（γ-H2AX）作為復(fù)制應(yīng)激的可靠標(biāo)記，以及在7和14天后DNA雙鏈斷裂的存在。作者發(fā)現(xiàn)，在OVCAR-8和p53 mRNA處理的OVCAR-8細(xì)胞中，γ-H2AX焦點(diǎn)的基線水平在處理14天后從平均8個(gè)焦點(diǎn)顯著下降到3個(gè)焦點(diǎn)（圖2E）。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了p53在維持HGSOC細(xì)胞基因組完整性中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，最有可能是通過(guò)對(duì)抗復(fù)制應(yīng)激。

圖2 恢復(fù)p53功能可降低OVCAR-8細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定性

3. 在原代HGSOC細(xì)胞中，基于mRNA的p53功能挽救誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞死亡

為了進(jìn)一步驗(yàn)證p53表達(dá)在臨床前的挽救作用，作者比較了p53 mRNA轉(zhuǎn)染在正常卵巢和HGSOC細(xì)胞中的作用。除角質(zhì)形成細(xì)胞外，所有原始樣本均檢測(cè)到p53的表達(dá)（圖3A）。對(duì)同一患者的HGSOC和相應(yīng)的正常卵巢組織進(jìn)行的第一次比較顯示，腫瘤細(xì)胞中p53的表達(dá)較高，盡管轉(zhuǎn)染的p53 mRNA的量相同（圖3A）。對(duì)其他患者來(lái)源組織的分析證實(shí)，所有腫瘤樣本中的p53表達(dá)和caspase 3/7活性（圖3B）均顯著高于正常卵巢細(xì)胞中的相應(yīng)水平。

WB檢測(cè)揭示了抑制劑，p21，p16和p27的上調(diào)（圖3C）和凋亡（圖3D），在p53-mRNA-轉(zhuǎn)染的原代HGSOC細(xì)胞中，與它們的正常對(duì)應(yīng)細(xì)胞相比，凋亡更強(qiáng)，與HGSOC克隆數(shù)量的更明顯減少相關(guān)（圖3E），這被LDH-Glo細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)（圖3F）。對(duì)不同HGSOC患者來(lái)源的類器官的分析也表明，在3D細(xì)胞培養(yǎng)條件下，p53 mRNA處理后，體積顯著減小，caspase 3/7活性增加（圖3G）。綜上所述，雖然p53的表達(dá)降低了兩種原代細(xì)胞的活（正常細(xì)胞vs. HGSOC），但與正常細(xì)胞相比，在原代HGSOC細(xì)胞中的作用顯著更強(qiáng)，這可能是由于p53在腫瘤細(xì)胞中的水平升高。

圖3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染p53-mRNA導(dǎo)致p53在原代HGSOC細(xì)胞中的表達(dá)高于其正常對(duì)照。

4. 拯救野生型p53功能后OVCAR-8細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組改變

在HGSOC來(lái)源的細(xì)胞系和原代細(xì)胞中，作者觀察到細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞死亡增加，這支持了mRNA轉(zhuǎn)染后p53重新表達(dá)后恢復(fù)p53功能的模型。為了加深作者對(duì)潛在生物學(xué)過(guò)程的理解，并以相對(duì)無(wú)偏倚的方式解決這方面的問(wèn)題，作者在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染1μg p53 mRNA或模擬對(duì)照（EGFP mRNA）。總共有25540個(gè)人類基因在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)被RNA測(cè)序分析。考慮到組間差異，兩組均使用非配對(duì)T檢驗(yàn)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，3061個(gè)轉(zhuǎn)錄本被上調(diào)，1662個(gè)被下調(diào)（圖4A-B）。使用IPA軟件對(duì)這些重要基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，以確定與p53 mRNA轉(zhuǎn)染相關(guān)的過(guò)度表達(dá)的經(jīng)典通路（圖4C）。

與p53作為腫瘤抑制因子參與誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡的促凋亡功能相一致，作者的IPA揭示了p53 mRNA轉(zhuǎn)染后的幾個(gè)相關(guān)通路的過(guò)度表達(dá)，如“p53信號(hào)”、“凋亡信號(hào)”和幾個(gè)“細(xì)胞周期”通路（圖4C）。為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，作者研究了參與IPA“p53信號(hào)”通路的所有基因，作者意識(shí)到其中大多數(shù)（51/81，63%）在FDR q<0.05和絕對(duì)FC>1.5時(shí)存在差異表達(dá)（圖4D）。值得注意的是，p53信號(hào)通路的大多數(shù)已知下游靶點(diǎn)通過(guò)p53 mRNA轉(zhuǎn)染協(xié)同上調(diào)（圖4D）。作者對(duì)p53信號(hào)通路中選擇的蛋白（包括p21（CDKN1A）、MDM2、Puma（BBC3）、p73、FAS（CD95）和CDK1）進(jìn)行WB，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些結(jié)果（圖4E）。它們?cè)?span>OVCAR-8細(xì)胞中的表達(dá)被p53-mRNA顯著上調(diào)或下調(diào)，這與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析一致。

一些“細(xì)胞周期”途徑，包括“染色體復(fù)制的細(xì)胞周期控制”，“細(xì)胞周期：G2/M DNA損傷檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)”，和“細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)”，以及“Polo樣激酶的有絲分裂作用”，它們顯示了整體下調(diào)（負(fù)z值）（圖4C）。值得注意的是，細(xì)胞衰老途徑也被上調(diào)，并可能在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞死亡（圖4C）。

圖4 p53 mRNA轉(zhuǎn)染的OVCAR-8細(xì)胞與模擬轉(zhuǎn)染的OVCAR-8細(xì)胞相比，差異表達(dá)基因的鑒定

接下來(lái)，作者對(duì)來(lái)自患者1的原代HGSOC細(xì)胞和OVCAR-8細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組比較，OVCAR-8細(xì)胞和患者1的原代HGSOC細(xì)胞均轉(zhuǎn)染了p53-mRNA（圖5A）。主要樣本之間的高變異性導(dǎo)致多重檢驗(yàn)FDR校正后的低顯著性。因此，作者認(rèn)為原代HGSOC細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄顯著性P<0.01和FC>1.5。共有156個(gè)轉(zhuǎn)錄本被上調(diào)，115個(gè)被下調(diào)（圖5B-C）。來(lái)自原代HGSOC細(xì)胞的幾個(gè)基因是顯著的，并且與在OVCAR-8細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的通路相似（圖5D），支持兩個(gè)數(shù)據(jù)集的相關(guān)性。

圖5 原代HGSOC細(xì)胞差異表達(dá)基因分析。

與p53在OC發(fā)育中的重要功能一致，作者的IPA顯示了“卵巢癌信號(hào)”通路中的多個(gè)轉(zhuǎn)錄改變。該通路中的許多基因（55/76，72%），包括Wnt/β-catenin信號(hào)通路，被顯著地解除調(diào)控（圖6A-B）。Wnt/β-catenin通路通過(guò)異常激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，導(dǎo)致catenin過(guò)度激活，從而促進(jìn)卵巢癌的化療耐藥、轉(zhuǎn)移和腫瘤干細(xì)胞的自我更新。p53 mRNA的處理導(dǎo)致AXIN1的表達(dá)上調(diào)，AXIN1是β-catenin破壞復(fù)合物成分的腳手架蛋白，包括APC, CK1PP2A和GSK3β。此外，在frizzled受體、Wnt和TCF/LEF家族成員中觀察到異常（圖6A-B）。總之，在p53-mRNA處理的細(xì)胞中，這些轉(zhuǎn)錄改變導(dǎo)致β-catenin的適度減少（圖6B），并通過(guò)TCF/LEF報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)降低Wnt信號(hào)的活性（圖6C）。

圖6 IVT p53 mRNA處理OVCAR-8細(xì)胞后，OC信號(hào)通路上調(diào)。

5. 在HGSOC異種移植模型中，p53 mRNA處理的OVCAR-8細(xì)胞的原位應(yīng)用導(dǎo)致了劑量依賴性的腫瘤生長(zhǎng)減少

在異種移植實(shí)驗(yàn)的前一天，OVCAR-8/Luc細(xì)胞被轉(zhuǎn)染mock-mRNA或p53-mRNA（100 ng或500 ng）（圖7A）。為了建立原位模型，將Matrigel/OVCAR-8/Luc細(xì)胞懸液注射到每只小鼠的右側(cè)卵巢。在為期10周的觀察期間，BLI以每周1倍的速度測(cè)定腫瘤體積，結(jié)果表明，100ng p53-mRNA處理的細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤生長(zhǎng)遲緩，以及500ng p53-mRNA處理的細(xì)胞增殖完全受阻（圖7B）。為驗(yàn)證熒光素酶在體內(nèi)的活性，研究結(jié)束后處死小鼠，由兩名獨(dú)立的獸醫(yī)組織學(xué)學(xué)家對(duì)所有器官進(jìn)行解剖/組織學(xué)檢查。基于體積測(cè)定（圖7C）和BLI測(cè)量（圖7D）對(duì)切除的卵巢的檢查證實(shí)了通過(guò)支持In vivo BLI測(cè)量的p53 mRNA治療對(duì)卵巢腫瘤的劑量依賴性大小減少（圖7B）。組織學(xué)檢查顯示巨大的腫瘤腫塊和深刻的形態(tài)學(xué)改變，這是由于在注射了模擬處理的OVCAR-8/Luc細(xì)胞的右側(cè)卵巢中巨大的癌組織。在100ng p53-mRNA處理組中，右側(cè)卵巢顯示出低到中等數(shù)量的腫瘤(圖7E，d-e)或正常組織學(xué)。500ng p53-mRNA處理組的右側(cè)卵巢和所有其他器官顯示正常組織學(xué)（圖7E，g-h）。在所有處理組（mock，100ng和500ng p53-mRNA）中，未接受OVCAR-8/Luc細(xì)胞的左側(cè)卵巢顯示出正常的組織學(xué)，具有卵泡和黃體結(jié)構(gòu)，以及基質(zhì)組織（圖7E，c-f-i)。在注射了mock-treated細(xì)胞的小鼠中，在腸道中檢測(cè)到轉(zhuǎn)移；100-ng組的轉(zhuǎn)移活性較低，在500-ng組中沒(méi)有轉(zhuǎn)移活性（圖7D-F）。總之，這些動(dòng)物數(shù)據(jù)揭示了在原位條件下，p53 mRNA處理的OVCAR-8/Luc細(xì)胞的劑量依賴性生長(zhǎng)遲緩和播散受阻。

圖7 在原位小鼠模型中，應(yīng)用脂質(zhì)體p53-mRNA到OVCAR-8細(xì)胞可防止鞘內(nèi)生長(zhǎng)和播散。

6. 腹腔內(nèi)應(yīng)用OVCAR-8細(xì)胞，隨后腹腔內(nèi)治療p53-mRNA抑制腫瘤細(xì)胞的播散

為了進(jìn)一步驗(yàn)證p53-mRNA在轉(zhuǎn)移性HGSOC中的臨床相關(guān)性，作者測(cè)試了腹膜內(nèi)散在的腫瘤細(xì)胞是否可以被脂質(zhì)體p53-mRNA所接近。治療OC的藥物腹腔給藥被證明比全身給藥更有效，美國(guó)國(guó)立癌癥研究所推薦腹腔給藥。沿著這些路線，作者腹腔注射2×106 OVCAR-8/Luc細(xì)胞，并在4-6小時(shí)后通過(guò)腹腔途徑給予p53-mRNA。小鼠每周2次腹腔注射p53-mRNA（0.16mg/kg）或?qū)φ战M，共治療3周。盡管對(duì)照組的OVCAR-8/Luc細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)，但脂質(zhì)體p53-mRNA腹腔內(nèi)處理完全阻斷了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖8A）。在整個(gè)觀察期間，兩組小鼠體重發(fā)育正常（圖8B）。

在接受腹腔OVCAR-8/Luc細(xì)胞和腹腔模擬治療的對(duì)照小鼠中，大體解剖分析顯示腹膜表面有腫瘤塊（圖8C-D）。大多數(shù)轉(zhuǎn)移灶與臟器附著較弱。在大網(wǎng)膜、卵巢脂肪墊和腸系膜等脂肪組織中也檢測(cè)到大腫瘤（圖8C-D）。特別是，附著在小腸和大腸的較大腫瘤塊會(huì)導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)之間的粘連，這意味著腸道狹窄。大網(wǎng)膜和腸道的IVIS測(cè)量顯示了最顯著的信號(hào)，與組織學(xué)結(jié)果相關(guān)（圖8D-E）。在p53-mRNA處理的小鼠中，大體解剖和組織學(xué)分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)的腫瘤團(tuán)塊，所有的器官在肉眼檢查中顯示正常。IVIS測(cè)量和組織學(xué)檢查沒(méi)有提供腫瘤細(xì)胞播散的證據(jù)（圖8D-E）。

圖8 腹腔內(nèi)注射OVCAR-8細(xì)胞后腹腔內(nèi)治療小鼠脂質(zhì)體p53-mRNA防止腫瘤形成和異種移植小鼠模型的器官播散。

結(jié)論：

該研究證明了IVT mRNA激活HGSOC中TP53腫瘤抑制基因的有效性。脂質(zhì)體IVT mRNA可有效、持續(xù)地表達(dá)WT p53，并精確挽救p53功能；從而抑制HGSOC細(xì)胞增殖，降低染色體不穩(wěn)定性，觸發(fā)細(xì)胞死亡。在不同的小鼠模型中，p53-mRNA治療導(dǎo)致了劑量依賴性的腫瘤生長(zhǎng)和腹膜腔內(nèi)播散的減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，基于IVT-mRNA的方法有希望在癌細(xì)胞中重新激活p53，并可能為HGSOC提供一個(gè)有價(jià)值的治療選擇。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，集落形成試驗(yàn)，類器官，免疫印跡，細(xì)胞周期、細(xì)胞活力和增殖分析，熒光素酶檢測(cè)，乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性測(cè)定，RNA測(cè)序，TCF/LEF報(bào)告基因檢測(cè)，小鼠實(shí)驗(yàn)，活體成像系統(tǒng)，組織學(xué)檢查

參考文獻(xiàn)：

Raab M, Kostova I, Pe?a-Llopis S, Fietz D, Kressin M, Aberoumandi SM, et al. Rescue of p53 functions by in vitro-transcribed mRNA impedes the growth of high-grade serous ovarian cancer. Cancer Commun (Lond). 2024 Jan;44(1):101-126. doi: 10.1002/cac2.12511.