m6A修飾目前被認為是維持癌細胞穩態的RNA功能的主要驅動因素。LncRNA控制細胞增殖，在結直腸癌(CRC)的發生和發展中發揮重要作用。ZCCHC4是一種新發現的m6A甲基轉移酶，其在腫瘤中的作用和機制尚未闡明。我們報道了ZCCHC4-LncRNAGHRLOS-KDM5D軸在體外和體內調控CRC的生長。我們發現ZCCHC4在原發性結直腸癌樣本中表達上調，可以預測結直腸癌患者的不良臨床結局。機制上，ZCCHC4下調LncRNAGHRLOS促進結直腸癌的發生。KDM5D作為LncRNAGHRLOS的下游分子，直接控制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究提示ZCCHC4軸參與結直腸癌的腫瘤發生和進展，ZCCHC4可能是這種惡性腫瘤的潛在生物標志物。本文于2024年2月發表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。

技術路線

結果：

1）ZCCHC4在結直腸癌組織中表達上調，預示結直腸癌預后不良

          為了確定m6A在不同消化道腫瘤中的表達程度，我們隨機選取5對有相鄰組織樣本的臨床腫瘤組織，評估m6A的總體修飾水平(圖1A-F)。HCC和CRC組織中m6A水平明顯高于鄰近正常組織。考慮到m6A在HCC中的廣泛研究，我們選擇CRC作為本研究的對象。同樣，我們在5個CRC標本中檢測到一些關鍵的m6A成分。最后，我們證實了METTL3、FTO和ZCCCHC4在癌組織和癌旁組織中的表達存在顯著差異(圖1G)。在敲除ZCCHC4后，在大多數CRC細胞系中觀察到m6A表達下降(圖1H)。為探討ZCCHC4在結直腸癌中是否存在異常表達，我們采用免疫組化方法檢測243例結直腸癌患者ZCCHC4的表達水平，并采用qPCR方法分析30例結直腸癌組織樣本中ZCCHC4 mRNA的表達情況。免疫組化結果顯示，175例患者腫瘤組織中ZCCHC4高表達，低表達患者僅占26.47%(圖1I)。ZCCHC4的mRNA水平在大多數結直腸癌組織中較高(圖1J)。對三對結直腸癌及其鄰近癌組織進行western blot分析后也得到了類似的結果(圖1K)。此外，ZCCHC4高表達的結直腸癌患者預后明顯差于低表達組(圖2A)。這些結果表明，ZCCHC4高表達與較差的OS相關。

2）ZCCHC4在體內和體外均與結直腸癌細胞的生物學行為有關

          為了確定ZCCHC4在結直腸癌進展中的潛在作用，我們首先評估了ZCCHC4在結直腸癌細胞系中的表達。我們檢測了幾種結直腸癌細胞系中ZCCHC4的水平，發現與正常結腸上皮細胞系NCM460相比，大多數結直腸癌細胞系中ZCCHC4的mRNA和蛋白水平均升高(圖2B-C)。通過Transwell細胞實驗研究ZCCHC4對CRC細胞侵襲和遷移能力的影響(圖2D)。結果顯示，在HCT-15細胞系中，與對照組相比，下調ZCCHC4表達可顯著降低CRC細胞的侵襲和遷移能力。CCK-8結果顯示ZCCHC4下調可顯著抑制HCT-15和HCT116細胞的增殖(圖2E-F)。這些結果被傷口愈合實驗證實(圖2G)。通過檢測細胞周期，我們觀察到ZCCHC4表達下調導致HCT-116和HCT-15細胞系中處于G1期的CRC細胞比例更高(圖2H-I)。鑒于ZCCHC4對維持結直腸癌細胞增殖至關重要，我們通過裸鼠異種移植模型驗證了ZCCHC4在結直腸癌腫瘤發生中的體內作用。ZCCHC4高表達組CRC細胞在裸鼠體內的生長能力增強，體積增大(圖3A-D)，腫瘤重量增加(圖3E)，預后差(圖3F)。免疫組化結果顯示，與過表達組相比，ZCCHC4缺陷腫瘤中細胞增殖的分子標志物Ki-67減少，這表明ZCCHC4可能是CRC腫瘤發展的驅動因素(圖3G)。

3）LncGHRLOS被鑒定為ZCCHC4的下游靶點

          為了探索ZCCHC4在結直腸癌中的潛在靶點，我們對表達ZCCHC4和對照結直腸癌細胞系進行了RNA分析。RNA-seq結果顯示，ZCCHC4過表達后，大部分轉錄本下調。火山圖用于可視化差異表達基因的總體分布(圖4A)。基因表達聚類分析用于確定不同處理下基因表達的聚類模式(圖4B)。將所有基因的蛋白序列和鑒定出的差異表達基因與UniProt數據庫中的蛋白序列進行比對，并根據UniProt數據庫中已知的蛋白GO注釋對比對結果進行標注(圖4 C)。使用R中的“clusterpro消化”包富集鑒定的差異表達基因在KEGG代謝途徑中(圖4D)。為了鑒定在ZCCHC4下游發揮關鍵作用的主要靶基因，基于MeRIP-seq結果，結合RNA seq結果中ZCCHC4過表達后發生顯著變化的基因，我們鑒定了11個共有基因(圖4E)。通過文獻檢索，我們選擇了CPA4、Col5A3、lncGHRLOS和CLEC18B作為ZCCHC4的潛在下游靶點(圖4F)。在10對結直腸癌組織和鄰近正常組織中檢測這些分子的mRNA表達后，我們發現兩組之間只有lncGHRLOS存在差異，我們將lncGHRLOS作為候選分子進行進一步驗證(圖4G-J)。我們首先利用以上50個樣本的PCR結果描述了lncGHRLOS與ZCCHC4之間的相關性，結果顯示兩者呈負相關關系(圖4K-L)。此外，在敲除ZCCHC4的表達后，我們檢測到CRC細胞系中lncGHRLOS mRNA水平顯著升高(圖4M)。RNA pull-down和RIP實驗也顯示了ZCCCHC4和lncGHRLOS轉錄本之間的結合(圖4N-O)。值得注意的是，ZCCHC4消融減緩了CRC細胞中lncGHRLOS的降解，而ZCCHC4過表達加速了lncGHRLOS轉錄本的降解(圖4P)。因此，我們推測lncGHRLOS可能是ZCCHC4的下游效應物。

4）LncGHRLOS在體外和體內均能抑制結直腸癌的增殖、侵襲和遷移

          為了驗證lncGHRLOS在CRC中的獨特作用，我們首先分析了CRC細胞系中的lncGHRLOS (圖5A)。CCK-8活性實驗表明，沉默lncGHRLOS可有效增強CRC細胞的增殖能力，而增強lncGHRLOS的表達則會產生相反的生物學效應(圖5B)。通過傷口愈合實驗來確定細胞的遷移能力(圖5C-D)。我們的研究結果顯示，過表達lncGHRLOS后，CRC細胞的遷移能力與普通CRC細胞相比明顯降低，與低表達lncGHRLOS組相比存在顯著差異(圖5E)。隨后，我們用穩定過表達lncGHRLOS的CRC細胞接種裸鼠，研究lncGHRLOS對致瘤性的影響。值得注意的是，lncGHRLOS的過表達減少了裸鼠CRC細胞的生長，導致腫瘤體積變小(圖5F-G)，腫瘤重量減輕(圖5H)，預后更好(圖5I)。免疫組化結果顯示，與相應的對照組相比，lncGHRLOS過表達的腫瘤中細胞增殖的分子標志物Ki-67下調(圖5J)。對結直腸癌患者樣本進行PCR檢測和ROC分析顯示，lncGHRLOS在臨床結直腸癌診斷中具有顯著的分化作用(圖5K)。根據隨訪結果繪制患者生存曲線。結果顯示，lncGHRLOS高表達組患者生存期較長(圖5L)。

5）ZCCHC44和LncGHRLOS共同調控KDM5D的表達

          通過RNA下拉實驗和質譜分析研究LncGHRLOS的潛在下游靶點。質譜分析表明，KDM5D可能在LncGHRLOS的m6A修飾中發揮作用(圖6A)。我們利用PCR結果的中位數將臨床標本中KDM5D高表達和低表達的患者分組，發現KDM5D在結直腸癌中表達較低，其低表達在結直腸癌患者中預后較差(圖6B)。ELISA結果也顯示KDM5D有可能成為CRC的標志物(圖6C)。選擇結直腸癌及癌旁組織進行PCR實驗，確定KDM5D mRNA水平(圖6 D)。此外，在結直腸癌中，LncGHRLOS與KDM5D mRNA表達呈顯著正相關(圖6E)。細胞系驗證實驗證實，敲低LncGHRLOS后，KDM5D的表達顯著降低(圖6F-H)。重要的是，我們評估了敲低和過表達KDM5D后LncGHRLOS mRNA的穩定性。結果發現，放線菌素D處理下，過表達KDM5D后，LncGHRLOS的mRNA穩定性顯著提高，而敲低KDM5D后，LncGHRLOS的mRNA穩定性顯著降低(圖6I)。在許多CRC細胞系中觀察到KDM5D mRNA的表達顯著降低(圖6J)。接下來，我們使用傷口愈合實驗(圖6K)、CCK-8實驗(圖6L)、transwell實驗(圖6M)和流式細胞術(圖6N)來驗證KDM5D敲低和過表達對結直腸癌細胞生物學行為的影響。我們發現KDM5D的高表達降低了HCT-116細胞的增殖和遷移能力。細胞周期在G0/G1期停滯。此外，我們進行了體內實驗來闡明KDM5D對CRC的影響。裸鼠成瘤實驗顯示，KDM5D低表達組CRC細胞在裸鼠體內的生長能力增強，體積增大(圖6O-P)，腫瘤重量增大(圖6Q)， Ki-67指數增大(圖6S)。但與以往實驗不同的是，兩組小鼠的生存時間沒有顯著差異(圖6R)。

結論：

          我們的研究確定了ZCCHC4是CRC不良預后的新預測因子和潛在的治療靶點，為其在癌癥進展中的作用提供了機制見解。

實驗方法：

          m6A RNA甲基化試驗，ELISA，IHC，Western blot，qRT-PCR，MeRIP-seq，RIP，transwell，傷口愈合試驗，RNA下拉，質譜。

參考文獻：

          Chen K, Zhang J, Meng L, Kong L, Lu M, Wang Z, Wang W. The epigenetic downregulation of LncGHRLOS mediated by RNA m6A methylase ZCCHC4 promotes colorectal cancer tumorigenesis. J Exp Clin Cancer Res. 2024 Feb 7;43(1):44. doi: 10.1186/s13046-024-02965-5.