Hedgehog-Gli1信號誘導胰腺導管腺癌(PDAC)中兩種常見神經特征的發展：外周神經侵襲(PNI)和外周神經重塑(PNR)。然而，Gli1衍生的背根神經節（PNR）在癌細胞和神經中的潛在分子機制尚未得到全面分析。我們首先通過外泌體circ-0011536和DRG之間的串擾確認了PNR發生的分子機制。在Gli1過表達的PDAC中，circ-0011536主要由外泌體分泌。被DRG攝入后，通過降解miR-451a，上調VGF的表達，促進DRG的活性。Gli1過表達可加速小鼠皮下腫瘤的增殖，與神經叢密度密切相關，而circ-RNA下調可抑制腫瘤增殖，降低神經叢密度。此外，TMA結果證實Gli1過表達可顯著增加VGF的表達，并與神經叢密度增加密切相關。Hedgehog-Gli1誘導的外泌體circ-0011536通過miR-451a/VGF軸促進PNR，從而確定它可能通過激活Hedgehog信號通路促進PDAC相關的神經變化。本文于2023年12月發表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。

技術路線：

結果：

1）Gli1促進PDAC細胞的增殖和侵襲

         為了研究Gli1上調是否促進PDAC細胞系的腫瘤進展，我們首先通過qRT-PCR和Western blotting檢測了5種PDAC細胞系中Gli1的表達。與HPDE相比，至少有4個PDAC細胞系中Gli1表達上調，而Gli1的mRNA和蛋白表達在CFPAC和PANC-1細胞中相對較低(補充圖)。為了進一步研究Gli1在PDAC細胞進展中的功能作用，我們在CFPAC和PANC-1細胞中構建了Gli1慢病毒(lentii-Gli1)，并使用空病毒(EV-Gli1)作為對照。通過qPCR和Western blotting驗證了Gli1在RNA和蛋白質水平上過表達的影響(圖1A-C)。此外，我們使用CCK-8方法檢測Gli1表達上調對PDAC細胞增殖的影響。結果顯示，過表達Gli1組的細胞增殖率明顯高于空白對照組(圖1D)。Transwell法檢測Gli1在PDAC細胞侵襲能力中的作用。結果顯示，培養24 h后，lenti-Gli1組通過底部聚碳酸酯膜的細胞數量明顯高于EV-Gli1組，細胞數量差異有統計學意義(圖1E)。同樣，Western blot結果證實，與增殖和侵襲相關的基因Ki-67和E-cadherin也表現出與功能一致的趨勢 (圖1F)。

2）Gli1誘導PDAC細胞介導的DRG趨化

         為了進一步表征觀察到的神經元變化的潛在分子基礎，我們構建了一個體外共培養模型，使用DRG細胞作為神經元元件。提取小鼠DRG，構建PDAC-DRG共培養模型。實驗結果顯示，與EV-Gli1對照組相比，lenti-Gli1組通過Transwell細胞的DRG細胞數量明顯增加(圖2A、B)。為了進一步研究Gli1信號在神經元可塑性中的功能作用，我們以NGF為對照，觀察DRG軸突延伸長度。結果表明，lenti-Gli1組促進PDAC細胞DRG軸突延伸，其作用類似于NGF的產生。以不含NGF的空血清(SF組)為對照(圖2C)。此外，Gli1過表達還能保護DRG免受血清饑餓誘導的細胞凋亡。通過Annexin V/PI檢測，當Gli1過表達的PDAC細胞與DRG共培養時，細胞中caspase-3的表達顯著降低(圖2D-F)。上述研究表明，在PDAC細胞中激活Gli1可以促進DRG細胞趨化和軸突神經伸展，同時避免饑餓誘導的細胞凋亡的發生。

3）Gli1通過PDAC誘導的外泌體作用于DRG

         提取上清液進行外泌體分離，并通過透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析(NTA)分析和Western blotting對所得物質進行驗證。電鏡觀察結果顯示，提取物呈碟狀透明，具有完整的囊泡膜結構。NTA結果表明，提取的外泌體的體積主要為130 nm，與以往文獻一致，驗證了胰腺癌細胞系CFPAC-1中外泌體的存在。Western blotting結果顯示外泌體標記蛋白CD63和TSG101陽性 (圖3A-C)。為了確認PDAC細胞衍生的外泌體是否可以轉移到DRG受體上，我們提取lenti-Gli1組和EV-Gli1組的外泌體，用PKH26染料標記，過濾后加入到DRG，與DRG共培養24 h，結果顯示外泌體被聚焦在細胞周圍并被細胞吸收(圖3D)。同時，lenti-Gli1組的外泌體延長了DRG的軸突延伸(圖3E, F)。這表明，對DRG的影響可能是由源自PDAC細胞的外泌體實現的。

4）攜帶傳輸信號的外泌體中circRNA的篩選和驗證

         我們提取RNA并對過表達Gli1的CFPAC-1細胞進行RNA測序。在鑒定的lncRNA、circRNA和microRNA中，circRNA存在顯著差異。我們鑒定出2621個差異表達基因，其中1530個表達上調，1091個表達下調。對差異基因進行KEGG通路富集分析，共篩選出18個與Neurotropin信號通路相關的circRNA，包括9個上調基因和9個下調基因(圖4A)。為了闡明潛在的機制，我們評估了9個上調基因的表達水平。hsa-circ-0011536的表達同步升高，差異顯著(圖4B-D)。同樣，我們用從Gli1過表達的細胞中提取的外泌體處理DRG并進行測序。共鑒定出6718個上調基因和5578個下調基因。聚類后，發現59個基因參與了神經活性配體-受體相互作用途徑(圖4E)。選擇前7個差異顯著的基因進行qPCR檢測。在lenti-Gli1處理的DRG細胞中，VGF被發現上調(圖4F)。這些發現表明外泌體可能攜帶circ-0011536并將其傳遞給DRG細胞，從而改變VGF并導致下游效應。

5）攜帶circ-0011536的外泌體通過miR-451a作用于DRG細胞

         我們分別構建了在EV-Gli1和lenti-Gli1 PDAC細胞中過表達和敲低hsa-circ-0011536的載體。在驗證circRNA表達后，我們初步評估了VGF在DRG細胞中的表達，顯示出外分泌效應。VGF的表達與circRNA的變化一致(圖5A)。此外，lenti-has-circ-0011536和lenti-Gli1 CFPAC-1細胞分泌的外泌體同樣促進軸突伸長(圖5B)。由于DRG和PDAC細胞來自不同的物種和屬，因此在DRG細胞中將has-circ-0011536轉化為同源基因mum -circ-0001261進行檢測。序列比較分析表明，這兩個基因具有高度保守性。我們隨后在外泌體處理的DRG細胞中檢測了VGF mRNA和蛋白。Gli1和has-circ-0011536過表達的CFPAC-1細胞的分泌物顯示，mmu-circ-0001261和VGF的表達升高(圖5C, D)。我們使用熒光素酶測定mmu-circ-0001261與VGF的結合；結果未顯示直接結合，因此表明mmu-circ-0001261可能參與內源性競爭性RNA的調控。ENCORI和Circineracoome數據庫預測了15個miRNA可能與mmucic-0001261互補，并且通過ENCORI、TargetScan、miRTarBase和miRDB預測了VGF上游的33個miRNA，經過DRG驗證，發現兩者交集的3個常見miRNA (mmu-miR-423-5p、mmu-miR-451a、mmu-miR-6921-5P)高度保守且差異顯著(圖5E)。為了進一步驗證miRNA的作用，我們構建了過表達mmu-circ-0001261的DRG細胞模型來模擬lenti-Gli1外泌體的作用。添加miR-451a模擬物后，VGF mRNA和蛋白表達下調(圖5F、G)。根據上述結果，我們初步確定PDAC細胞通過Gli1-circ-0011536-miR-451a-VGF通路作用并介導神經細胞變化。

6）Gli1衍生的外泌體circ-0011536通過miR-451a/VGF軸介導PNR

         我們構建了VGF siRNA，并在DRG細胞中進行了沉默驗證，以確定最有效的siRNA(圖6A, B)。隨后，我們進行拯救實驗。正如預期的那樣，miR-451a的過表達或VGF的沉默降低了VGF的mRNA和蛋白表達，也影響了DRGs的軸突延伸(圖6C-F)。熒光素酶報告基因檢測表明，mmic-0001261和miR-451a模擬治療抑制WT信號，而mmucic-0001261突變消除了miR-451a模擬的抑制作用。此外，miR-451a模擬物降低了DRG細胞中的VGF-WT熒光素酶報告信號，但對VGF-MUT載體沒有影響(圖6G)。我們的數據表明，在體外，在Gli1過表達的PDAC細胞中，外泌體攜帶的has-circ-0011536通過miR-451a/VGF軸調節DRG細胞的神經元變化。

7）血漿外泌體中circ-0011536的水平是與PNR相關的預后生物標志物

         為了確定circ-0011536在體內的作用，我們使用EV-Gli1和lenti-Gli1 CFPAC-1建立小鼠皮下致瘤模型。然后，我們對lenti-Gli1小鼠進行了circ-siRNA處理。首先，我們用蘇木精-伊紅染色和Ki-67染色來評估增殖水平，Ki-67核染色在lenti-Gli1組和陽性對照中較高。然而，在circ-siRNA處理后，在lenti-Gli1組織中觀察到Ki-67的表達顯著降低，從而表明在lenti-Gli1小鼠中具有抗增殖作用(圖7D, E)。此外，Gli1過表達的腫瘤生長更快，而circ-siRNA處理后腫瘤生長受到抑制(圖7A, B)。我們隨后通過PCR檢測腫瘤中Gli1和has-circ-0011536的表達，發現Gli1和circ-0011536的表達符合調控預期(圖7C)。腫瘤組織中mmu-circ-0001261的表達與神經密度呈正相關。用siRNA處理的小鼠在腫瘤中顯示出明顯的神經衰減(圖7F)。此外，在陽性對照組(PNST標本)和lenti-Gli1組中，Gli1和PGP9.5的細胞質染色均升高，而在circ-siRNA處理后，lenti-Gli1組織中幾乎沒有染色(圖7G)。雙免疫熒光染色結果顯示，Gli1過表達后神經叢密度增加，但隨著circ-siRNA的下調而降低(圖7G, H)。PNR患者血漿外泌體中has-circ-0011536的表達顯著升高(圖7I)。最后，我們通過熒光三重染色TMA驗證了Gli1與PNR之間的關系(圖7J)。結果證實Gli1表達與PNR密切相關，顯著增加VGF表達。上述結果提示circ-0011536可能在腫瘤中被Gli1上調，從而直接促進腫瘤內神經密度的增加，從而作為預測胰腺癌PNR的生物標志物。

結論：

         我們的研究表明外泌體circ0011536通過激活hedgehog-Gli1信號調節PDAC中的神經改變。此外，我們的研究結果表明circ-0011536通過海綿化miR-451a促進VGF的表達。外泌體和circRNA抗核酸酶的獨特優勢使它們成為研究新的生物標志物和生物學機制的極好的潛在工具。未來，胰腺癌與神經細胞之間的信號轉導通路還需進一步研究，為最終找到阻斷神經侵襲通路的治療策略奠定理論基礎。

實驗方法：

         Western blotting，PCR，CCK-8，Transwell，Annexin?V/PI染色，外泌體分離，RNA測序，熒光素酶報告試驗，免疫組化，免疫熒光。

參考文獻：

         Dai W, Wu X, Li J, Tang W, Wang Y, Xu W, Han D, Xu X, Xu X. Hedgehog-Gli1-derived exosomal circ-0011536 mediates peripheral neural remodeling in pancreatic cancer by modulating the miR-451a/VGF axis. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Dec 2;42(1):329. doi: 10.1186/s13046-023-02894-9.