piRNA在多種心血管疾病中高表達。然而，它們在缺血/再灌注(I/R)損傷引起的心肌細胞死亡中的作用，特別是壞死性凋亡，仍然是未知的。在這項研究中，發現心臟壞死性凋亡相關的piRNA (HNEAP)通過靶向DNMT1介導的m5C甲基化激活Atf7 mRNA轉錄物來調節心肌細胞壞死性凋亡。缺氧/再氧化(H/R)暴露的心肌細胞和I/R損傷的小鼠心臟中HNEAP表達水平顯著升高。缺失HNEAP可抑制小鼠心肌細胞壞死性凋亡，改善心臟功能。機制上，HNEAP直接與DNMT1相互作用，減弱Atf7 mRNA轉錄物的m5C甲基化，從而增加Atf7的表達水平。ATF7可進一步下調壞死性凋亡抑制劑Chmp2a的轉錄，導致Chmp2a水平降低，心肌細胞壞死性凋亡進展。研究結果表明，piRNA介導的m5C甲基化參與心肌細胞壞死的調控。因此，HNEAP-DNMT1-ATF7-CHMP2A軸可能是減輕缺血性心臟病壞死性凋亡引起的心臟損傷的潛在靶點。本文于2023年10月發表于“Advanced Science”（IF=15.1）上。

技術路線

結果

1）心肌壞死性凋亡相關piRNA的鑒定和表征

         為了系統地識別和研究參與心肌細胞壞死性凋亡的piRNA的功能，我們首先進行了piRNA微陣列分析(圖1a)。我們隨機選擇了20個piRNA(10個上調，10個下調)，這些piRNA在微陣列結果中與假手術心臟的表達存在差異，并通過qRT-PCR驗證了它們的表達水平。我們發現，與假手術組相比，4個piRNA顯著上調，2個下調(圖1b,c)。我們還檢測了缺氧/再氧化(H/R)處理的心肌細胞中這些piRNA的水平(補充圖)。其中，H/R損傷心肌細胞中piRNA DQ691316水平顯著升高。接下來，我們檢查了DQ691316在各種組織中的水平，發現它在心臟中更豐富(圖1d)。與心臟成纖維細胞相比，DQ691316主要在心肌細胞中表達(補充圖)?；谶@些結果，我們假設DQ691316可能在再灌注性心臟損傷中具有潛在的調節功能，并選擇DQ691316進行進一步研究。我們將這種未知的piRNA命名為心臟壞死相關piRNA (HNEAP)，并發現HNEAP在3 '端由2’-O-甲基化組成(圖1e)。隨后，我們觀察到HNEAP分布在細胞核和細胞質中(圖1f, g)。

2）抑制HNEAP可阻斷H/R誘導的心肌細胞壞死性凋亡

         采用H/R誘導心肌細胞損傷模型，評價HNEAP在心肌細胞壞死性凋亡中的作用。HNEAP的強制表達(圖2a)導致心肌細胞壞死性凋亡，表現為PI陽性心肌細胞數量增加(圖2b, c)，LDH活性增加(圖2d)。相反，使用抑制劑敲低HNEAP(圖2e, f)可減輕H/R誘導的心肌細胞壞死性凋亡(圖2g-i)。綜上所述，這些結果表明HNEAP參與心肌細胞壞死性凋亡的調節。

3）敲除HNEAP可減輕I/R損傷下的心臟損傷和壞死性凋亡

         為了研究HNEAP是否與心肌損傷有功能相關性，我們使用CRISPR技術生成了HNEAP基因敲除(HNEAP-KO)小鼠(圖3a)?；蚍中?span>(圖3b)和qRT-PCR分析(圖3c)證實KO小鼠中HNEAP缺失。為了全面了解HNEAP在I/R損傷中的作用，我們對小鼠心臟進行缺血1小時，再灌注3小時。在I/R損傷期間，HNEAP-KO小鼠心臟的心肌細胞壞死性凋亡明顯減少(圖3d, e)，與I/R損傷的WT小鼠相比，HNEAP-KO小鼠的心室功能得到改善(圖3f)，梗死面積減少(圖3g, h)。綜上所述，這些數據表明HNEAP缺乏可減輕心肌細胞壞死性凋亡，減輕I/R損傷引起的心功能障礙。

4）HNEAP結合DNMT1并調控其m5C甲基化活性

         我們探討了HNEAP調控心肌細胞壞死性凋亡的分子機制。我們使用生物素化的HNEAP進行了RNA下拉實驗，并檢測了心肌細胞中與HNEAP相互作用的表觀遺傳相關分子。采用LC-MS/MS對HNEAP結合蛋白進行鑒定。在這些蛋白中，我們選擇了DNA甲基轉移酶1 (DNMT1)(圖4a)。使用生物素化的HNEAP進行體外RNA拉下實驗，隨后進行免疫印跡，證實HNEAP與DNMT1結合(圖4b)。RIP后，我們進行qPCR，觀察到HNEAP在DNMT1組中富集(圖4c)，表明HNEAP和DNMT1在體內相互作用。這些結果表明HNEAP與DNMT1相互作用，參與m5C甲基化的調控。為了研究HNEAP調控m5C修飾的機制，我們在HNEAP-KO和WT小鼠心臟中進行了m5C甲基化RNA免疫沉淀測序(meRIP-seq)。在所有檢測到的m5C mRNA轉錄本中(圖4d)，超過一半包含一個m5C峰(圖4e)。在WT和HNEAP-KO小鼠中，m5C峰主要出現在起始和停止密碼子附近的編碼序列(CDSs)中(圖4f)。接下來，我們對HNEAP KO和WT小鼠心臟進行RNA-seq分析，探索m5C修飾與基因表達的關系(圖4g)，并將m5C峰值數據與基因表達的RNA-seq數據進行對比，將基因表達水平與m5C修飾水平進行關聯(圖4h)。

5）HNEAP抑制DNMT1介導的m5C修飾，促進Atf7 mRNA表達

         接下來，我們分別對差異甲基化和差異表達基因進行MeRIP-qPCR和qPCR。其中，HNEAP-KO心臟中Atf7的m5C修飾水平顯著升高，其表達水平顯著降低(圖5a-d)。相反，在HNEAP過表達的心肌細胞中，Atf7處的m5C富集減少(圖5e)，同時Atf7 mRNA和蛋白水平顯著增加(圖5f, g)。基于這些數據，我們選擇Atf7作為m5C調控心肌細胞壞死性凋亡的候選靶點。接下來，我們研究了HNEAP上調Atf7表達的機制。在HNEAP-KO小鼠心臟中，與WT小鼠心臟相比，DNMT1與Atf7 mRNA的結合明顯增加(圖5h)。此外，心肌細胞中DNMT1的強制表達增加了Atf7 mRNA的m5C修飾水平，降低了Atf7 mRNA和蛋白水平，當HNEAP過表達時，這種作用被抑制(圖5i-k)。綜上所述，這些觀察結果表明HNEAP通過DNMT1介導Atf7 mRNA的m5C修飾，這種甲基化修飾影響Atf7 mRNA的表達。

6）敲低Atf7可減輕心肌細胞壞死性凋亡

         為了證實ATF7在心肌細胞壞死性凋亡中的調控作用，我們敲低了心肌細胞中的ATF7。Atf7敲低可阻斷H/R誘導的心肌細胞壞死性凋亡(圖6a-d)。在體內，I/R手術后Atf7 mRNA和蛋白水平顯著升高(圖6e)。Atf7敲除(圖6e)減少心肌細胞壞死性凋亡(圖6f, g)，改善心室功能(圖6h)，縮小梗死面積(圖6i, j)。綜上所述，這些數據表明Atf7在心肌細胞壞死性凋亡的調控中起著至關重要的作用。

7）Atf7調節心肌細胞壞死性凋亡中CHMP2A的表達

         為了研究Atf7的下游效應，我們評估了與壞死性凋亡相關的關鍵因子的表達水平。具體而言，心肌細胞中Atf7沉默后，關鍵壞死性凋亡分子CHMP2A的表達水平升高(圖7a,b)。相反，Atf7過表達降低了Chmp2a的mRNA和蛋白水平(圖7c)，表明Atf7與Chmp2a呈負相關。接下來，我們評估Atf7是否直接靶向Chmp2a。我們構建了一個含有Atf7結合位點的Chmp2a啟動子(圖7d)，并使用熒光素酶報告基因試驗測試了Atf7對其活性的影響。Atf7敲除增加了Chmp2a結構體的熒光素酶活性(圖7e)。H/R誘導的Chmp2a轉錄減少在心肌細胞中Atf7敲除后減弱(圖7f)。這些結果表明Atf7通過直接結合其CHMP2A的啟動子區域抑制CHMP2A的表達。此外，我們研究了HNEAP是否通過靶向CHMP2A調節心肌細胞壞死性凋亡。結果顯示，與WT小鼠相比，HNEAP-KO小鼠心臟中Chmp2a mRNA和蛋白的表達水平顯著升高(圖7g)。HNEAP降低心肌細胞Chmp2a表達水平，誘導心肌細胞壞死性凋亡，而這些作用可通過敲除Atf7而逆轉(圖7h-j)。這些數據表明Atf7和CHMP2A是HNEAP調節心肌細胞壞死性凋亡的直接下游分子。

結論：

         我們的研究表明，HNEAP介導的RNA m5C修飾顯著有助于心肌細胞壞死性凋亡和心肌損傷。HNEAP可能是減輕I/R損傷后梗死面積和改善心功能的潛在靶點。

實驗方法：

         心肌缺血再灌注(I/R)損傷模型構建，Evans藍色染料測定法，PI染色，LDH活性測定，TUNEL，RNA pull down，m5C-IP-qPCR，FISH，Western Blot，qRT-PCR。

參考文獻：

         Wang K, Li FH, Zhou LY, Zhao XM, Gao XQ, Liu CY, Li XM, Chen XZ, Zhao Y, Cheng XL, Wang RQ, Li RF, Zhang YH, Gao F, Tian JW, Wang K. HNEAP Regulates Necroptosis of Cardiomyocytes by Suppressing the m5 C Methylation of Atf7 mRNA. Adv Sci (Weinh). 2023 Dec;10(34):e2304329. doi: 10.1002/advs.202304329.