與傳統的αβT細胞不同，固有自然殺傷T細胞（iNKT細胞）在胸腺中完成其終末分化為功能性的iNKT1/2/17細胞。然而，指導iNKT亞群分化的潛在分子程序仍然不清楚。在這里，作者利用單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞轉座可及染色質測序（scATAC-seq）對四個胸腺iNKT發育階段的超過17,000個iNKT細胞的轉錄組和超過39,000個iNKT細胞的染色質可及狀態進行了分析，以定義它們的發育軌跡。研究發現了iNKT前體和不同iNKT亞群的新特征，并表明iNKT2和iNKT17細胞系的發育可能在第0階段（ST0）早期就通過兩個不同的程序發生了，而iNKT1的發育可能發生在ST0之后。iNKT1和iNKT2細胞都表現出廣泛的表型和功能多樣性，而iNKT17細胞相對均一。此外，發現一個新的轉錄因子Cbfβ在iNKT前體中高表達，其表達軌跡與其他已知的iNKT細胞發育轉錄因子Zbtb16和Egr2相似，并且可以指導iNKT細胞命運并推動它們的效應器表型分化。通過條件性敲除Cbfβ，阻斷了早期iNKT細胞的發育，并導致iNKT1/2/17細胞分化嚴重受損。總的來說，本研究揭示了不同的iNKT發育程序以及它們的細胞多樣性，并確定了一個新的轉錄因子Cbfβ作為早期iNKT細胞發育的關鍵調節因子。本文于2023年6月發表在《Cell Discovery》IF: 33.5期刊上。

技術路線

主要實驗結果：

1、通過scRNA-seq和scATAC-seq對胸腺iNKT細胞在連續發育階段進行聚類

         為揭示iNKT細胞的發育景觀，采用熒光激活細胞分選（FACS）技術從連續發育階段中收集胸腺iNKT細胞，以進行scRNA-seq和scATAC-seq實驗（圖1a，b）。鑒于在C57BL/6小鼠中胸腺ST0（CD24+） iNKT細胞的稀缺性，利用Vα14-Jα18轉基因小鼠（也稱為rec-Vα14Tg）進行ST0 iNKT細胞分析，其TCR基因座與內源性TCR基因座非常相似，但具有豐富的ST0 iNKT細胞。如預期的，發現在rec-Vα14Tg和C57BL/6小鼠的ST0 iNKT細胞中，scATAC-seq譜的相似性很高。因此，進一步使用rec-Vα14Tg小鼠進行ST0 iNKT細胞的scRNA-seq分析，并使用C57BL/6小鼠進行ST1（CD24?CD44loNK1.1?）、ST2（CD24?CD44hiNK1.1?）和ST3（CD24?CD44hiNK1.1+） iNKT細胞的分析（圖1a–c）。

         經過質量控制過濾和排除細胞異常值后，共保留了17,944個高質量的單一胸腺iNKT細胞，總共表達了13,578個基因，用于隨后的scRNA-seq分析。在聚合的iNKT細胞（ST0–ST3）中鑒定16個簇，每個簇的細胞數量從255個到2817個不等（圖1d，e）。每個簇中最顯著差異表達的基因（DEGs）顯示在熱圖中（圖1f）和小提琴圖中（圖1g）。在這些簇中，有四個簇（C2，C4，C9和C14）來自ST0，八個簇來自ST1（C3，C5，C6，C7，C10，C11，C15和C16），九個簇來自ST2（C1，C3，C5，C6，C7，C10，C11，C13和C15），以及四個簇來自ST3（C1，C5，C8和C12）（圖1d）。ST0 iNKT細胞明顯與其他iNKT階段分離，而來自ST1和ST2 iNKT細胞的簇有適度的重疊，而來自ST3 iNKT細胞的簇與來自ST2 iNKT細胞的簇緊密相鄰（圖1d）。此外，相關性分析表明，同一階段內的不同簇呈相對相似的轉錄組模式。

圖1 小鼠胸腺iNKT細胞的多樣性

         細胞分化伴隨著由順式調控元件控制的基因的表達，這些元件必須處于開放狀態才能正常發揮功能。因此，對與scRNA-seq分析中相同發育階段的胸腺iNKT細胞進行了scATAC-seq分析，并繪制了單個iNKT細胞的染色質可及性景觀。在與scRNA-seq數據整合后，這十六個iNKT細胞簇很容易識別（圖2a）。由于scRNA-seq允許根據轉錄組推測當前細胞狀態，作者根據其特征轉錄組和細胞因子轉錄表達，將每個簇（C1–C16）分配到已發表的iNKT1、iNKT2和iNKT17功能亞群中。結果發現來自ST1和ST2的C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16簇被分類為iNKT2亞群；來自ST3主要的C1、C5、C8和C12簇被分類為iNKT1（圖2b）；而來自ST2的獨特iNKT C13被分配到iNKT17（圖2b）。ST0簇（C2、C4、C9和C14）在任何iNKT亞群中都不突出，因為它們沒有表現出強烈的效應特征（圖2b）。總體而言，通過整合轉錄組和表觀遺傳學特征，繪制了胸腺iNKT細胞的動態轉錄組和染色質景觀，揭示了iNKT1和iNKT2細胞的異質性以及iNKT17細胞的相對同質性。

圖2 不同的iNKT簇被分配到功能子集中

2、ST0中的兩個發育軌跡

         胸腺中iNKT細胞的發育依賴于位于胸腺皮質的大約1000個ST0 iNKT前體細胞（iNKTp）。在這里，作者鑒定了ST0中的四個簇（C2、C4、C9和C14）（圖1d和3a），并突出顯示了每個簇的特定特征（圖3b）。根據CD4和CD8的表達，這些ST0簇可以分為三組：C14是CD4+CD8+（DP）iNKTp；C9是CD4+CD8?（CD4SP）iNKTp，富含T淋巴細胞存活調節因子，包括Id2和Il7r；C2和C4是CD4?CD8?（DN）iNKTp，其中C4高度表達Cd5和Cd6，而C2 iNKTp豐富表達Egr2和Slamf6，它們分別通過調節PLZF表達和TCR信號強度，對iNKT細胞的發育至關重要（圖3b–d）。盡管先前的研究聲稱iNKT細胞要么是CD4?CD8?（DN），要么是CD4+CD8?（CD4SP），但在ST0中確實發現了一個小的CD4+CD8+（DP）iNKTp簇（C14）（圖3c–e）。

         將ST0 iNKTp組織成一個偽時間軌跡。鑒別了兩個潛在的發育分支，即C14-C2-C4分支（稱為DP-DN分支）和C14-C9分支（DP-CD4SP分支）（圖3f）。這兩個分支最終在表達趨化因子受體Ccr7增加的發育末端相遇（圖3g），Ccr7在ST0 iNKTp從胸腺皮質遷移到髓質中是必需的。通過流式細胞儀在蛋白質水平上進一步確認了DP、DN和CD4SP iNKTp中Ccr7的表達模式（圖3h）。因此， DP iNKTp下調CD8或同時下調CD4和CD8的表達，以啟動在胸腺皮質中的DP-CD4SP或DP-DN發育程序，最終遷移到胸腺髓質。

3、ST0中功性能iNKT亞型譜系

         接下來，想知道ST0中這兩個發育程序如何對iNKT亞型譜系產生影響。盡管PLZF被注釋為關鍵的iNKT2標志，但它對整體iNKT細胞的發育也至關重要，包括iNKT1和iNKT17細胞。因此，首先評估了Zbtb16（編碼PLZF）在ST0 iNKTp中的表達模式和染色質可及性。發現在DP iNKTp（C14）中，Zbtb16的+40?kb區域和TSS是不可及的，但在CD4SP（C9）和DN（C2和C4） iNKTp中是可及的，其中C2的開放性水平遠高于C4，這與Zbtb16的表達模式非常相似（圖3i，j）。偽時間軌跡和流式細胞儀進一步表明，Zbtb16在DN和CD4SP iNKTp中富集（圖3j，k）。鑒于iNKT2分化需要比iNKT1和iNKT17更強的TCR信號，因此CD4SP中的PLZF高表達iNKTp（C9）更有可能進入iNKT2細胞譜系。

         RORγt是調控iNKT17分化的關鍵轉錄因子，但也高度表達于未被信號刺激的DP胸腺細胞，并促進iNKT細胞選擇。與Zbtb16不同，在+4?kb區域的Rorc（編碼RORγt）在DP（C14）和DN（C2和C4）iNKTp中是可及的，但在CD4SP（C9）簇中不可及，而+13?kb到Rorc只在DP iNKTp（C14）中可及。Rorc的表達模式與每個簇中的染色質可及性狀態一致（圖3l）。Rorc在DP iNKTp中顯著高表達，并在DN分支（C4和C2）中逐漸下調，但在CD4SP（C4）中幾乎不可檢測（圖3m），這在流式細胞儀中得到了進一步驗證（圖3n）。總體而言，基于偽時間的發育軌跡分析揭示了ST0可能存在兩個潛在的發育程序，在這兩個程序中，iNKT細胞可能啟動對iNKT2和iNKT17細胞的發育，這早在ST0發生，而iNKT1細胞可能在ST0后啟動。然而，這一假設仍在進一步調查中。

圖3 ST0時期iNKT細胞的細胞多樣性

4、iNKT2細胞的細胞多樣性

         為了解ST0后iNKT子集的發展，將聚集的胸腺iNKT細胞(ST0 - 3)映射到偽時間軌跡中（圖4a）。iNKT2細胞展示了廣泛的多樣性，包括C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16簇（圖2b和4a, b）。首先評估了整合的iNKT細胞簇（C1–C16）中Zbtb16染色質的可及性。在Zbtb16位點的181 kb內，發現iNKT2、iNKT1和iNKT17簇中高度可訪問的區域，但在ST0簇（C2、C4、C9和C14）中區域較弱。Zbtb16的表達與其染色質可及性密切匹配（圖4c）。iNKT2簇和ST0中的C2和C9顯示了GATA3結合活性的高活性，GATA3對iNKT2分化至關重要（圖4d）。正如預期的那樣，對于iNKT2細胞的大多數標志基因，它們在中間階段逐漸增加，然后在終端分化期間下調。然而，一些基因，包括Btg1、Cebpb和Osgin1，僅在iNKT發育末端附近出現，這可能與iNKT2細胞的終末事件相關（圖4e）。

         先前的研究表明，ST1和ST2中的iNKT細胞經歷高度的增殖。細胞周期通路富集分析表明，iNKT2簇（C7、C11和C15）表現出高度增殖的特征，這些特征可能處于S期（C7）或G2/M期（C11和C15）（圖4f）。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）表明，簇C3、C6、C10和C16在功能上存在差異。C16是從ST0到ST1的iNKT細胞的短暫階段，這些細胞迅速上調了與糖酵解和氧化磷酸化都相關的基因的表達（圖4g），表明它們對能量的需求增加。C6在ST1中終止，這些細胞富集了與TCR信號、共刺激信號、細胞骨架、TNFR以及細胞死亡和衰竭通路相關的基因（圖4g）。總體而言，iNKT2展現出極大的細胞多樣性。

圖4 iNKT2細胞的細胞多樣性

5、iNKT1細胞的異質性

         iNKT1細胞分化受轉錄因子Tbx21的調控，分為四個簇（C1、C5、C8和C12）（圖2b和5a）。在Tbx21位點的17.2 kb內，啟動子區域–3 kb和–4 kb在C1、C5和C12中高度可訪問，但在C8中較不可訪問（圖5b）。這些相同的區域在ST1和ST2中的高增殖C7、C11和C15 iNKT2簇中也是可訪問的。重要的是，Tbx21結合位點的活性也發生在這些簇中，而在ST0簇中則不是如此（圖5c）。流式細胞儀分析進一步證實，ST1和ST2中的PLZFhiiNKT2細胞中有一小部分表達T-bet，并且通過Ki-67測量具有相當的增殖能力（圖5d）。因此，iNKT1的前體可能隱藏在這些所謂的高增殖PLZFhiT-bethi iNKT2細胞中。

         偽時間軌跡分析發現一個新的標志基因，Slamf7，在iNKT1細胞簇中富集（圖5e）。流式細胞儀進一步證實了這一點，基于PLZFloT-bethi iNKT1細胞中SLAM7和NK1.1表達之間的強相關性（圖5f）。與其他iNKT1細胞簇相比，NK細胞相關的標志基因Slamf4進一步區分了末端的C12。SLAMF4+ iNKT細胞（C12）主要是DN，逐漸從PLZFloT-bethi iNKT1細胞中分化出來（圖5g–i）。SLAMF4+ iNKT1細胞主要分泌IFN-γ，IL-4較少，類似于“經典iNKT1細胞”，而大多數SLAMF4? iNKT1細胞在刺激后分泌IL-4和IFN-γ（圖5j）。C5細胞富集了參與干擾素信號通路的Ifit1和Ifit3（圖5k）。總體而言，iNKT1細胞從ST1開始，起初表現為目前定義的“iNKT2細胞”，逐漸完成分化并最終轉化為末端的SLAMF4+ iNKT1細胞，即經典的分泌IFN-γ的iNKT1細胞。

圖5 iNKT1細胞具有廣泛的細胞異質性

6、iNKT17細胞表現出有限的多樣性

         C13被指定為iNKT17細胞，它在圖2b和6a中與其他簇明顯分開。觀察到Rorc的+4?kb和+14?kb區域在ST0簇（C2、C4和C14）和成熟的iNKT17簇（C13）中是可訪問的（圖6b），并且RORC的結合位點在iNKT17簇以及ST0 iNKTp中也被激活（圖6c）。這些數據表明，iNKT細胞可能在ST0開始其iNKT17分化，并在C13完成其分化。在mRNA水平上，Rorc在ST0的C14中高度表達，與Rorc的染色質可及性一致，但在C4和C2中逐漸下調，并在C13中重新上調，表明其他轉錄因子可能靶向開放的Rocr位點，并在iNKT17分化過程中調控Rorc的表達。

         為追蹤iNKT17細胞的發育軌跡，進一步在一個有序的iNKT細胞軌跡中檢查了iNKT17標志基因，并發現少數iNKT17標志基因，包括Rorc，在早期iNKTp中最初表達，然后在它們達到成熟的iNKT17之前。然而，大多數與iNKT17相關的標志基因在iNKTp中幾乎不表達（圖6d）。進一步發現一個新的標志基因， Aqp3，在胸腺iNKT17（PLZFintRORγt+）細胞中特異表達（圖6e，f）。總體而言，iNKT細胞可能在ST0啟動iNKT17分化，而這些iNKT17細胞表現出有限的多樣性。

圖6 iNKT17細胞表現出有限的異質性

7、Cbfβ調控iNKT細胞的早期分化

         先前的研究指出，Egr2和Slamf6通過調節Zbtb16的表達和TCR在ST0中控制早期iNKT細胞的發育。在這里，作者發現了一個新的共轉錄因子，Cbfβ，它與Egr2和Slamf6表現出相似的表達模式，并在iNKT細胞的ST0階段表現出很高的富集，特別是在DP-DN分支C2中（圖7a, b）。

         Cbfβ編碼的CBFB是一個非DNA結合的調節亞基，通過異構增強RUNX（RUNX1、RUNX2和RUNX3）的特異性DNA結合能力，從而調節它們目標基因的轉錄。為確定Cbfβ是否調節iNKT發育，檢查了胸腺特異性Cbfβ敲除小鼠（CD4CreCbfβ f/f，Cbfβ KO）中的iNKT細胞發育，其中Cbfβ1和Cbfβ2均被敲除。Cbfβ敲除導致胸腺iNKT細胞的頻率和絕對數量顯著減少（圖7c）。進一步更全面的分析揭示了Cbfβ KO小鼠中ST2和ST3 iNKT細胞的選擇性和顯著減少。Cbfβ KO小鼠中ST0和ST1 iNKT細胞的頻率顯著增加，但在Cbfβ KO和WT對照組之間，絕對數量是可比的（圖7d）。有趣的是，在Cbfβ KO小鼠的ST0 iNKT細胞中，DP iNKTp增加（圖7e），表明Cbfβ的敲除部分阻斷了DP iNKTp向CD4SP或DN譜系的轉化。作者推測Cbfβ可能影響DP階段的iNKT細胞選擇。

         ST1 iNKT細胞經歷迅速的增殖，并包含具有高Zbtb16編碼PLZF表達的iNKT亞群的前體。在這里，觀察到在Cbfβ KO iNKT細胞中，ST1時的PLZF表達顯著下調（圖7f）。在一個增殖標記Ki-67上也觀察到了類似的現象（圖7g）。這些數據表明，Cbfβ缺乏的iNKT細胞進入了相對靜止狀態，無法在ST1正常上調PLZF表達。此外，在ST1中殘留的PLZF+ iNKT細胞未能共同表達T-bet以啟動iNKT1分化，也未能共同表達RORγt以啟動iNKT17分化（圖7h，i）。總體而言，研究表明，Cbfβ在控制ST0時的早期iNKT細胞發育、ST1/2時的iNKT細胞分化以及ST3時的最終成熟中起到關鍵調節作用（圖7j）。

圖7 Cbfβ調控iNKT細胞早期細胞譜系

 實驗方法：

         構建條件性敲除小鼠，流式細胞術，骨髓嵌合體移植實驗，小鼠iNKT細胞富集和分選，qRT-PCR，WB，scRNA-seq，iNKT scRNA-seq數據集與參考文獻的比較分析，scATAC-seq，scRNA-seq和scATAC-Seq的整合分析

參考文獻：

         Wang J, Adrianto I, Subedi K, Liu T, Wu X, Yi Q, Loveless I, Yin C, Datta I, Sant'Angelo DB, Kronenberg M, Zhou L, Mi QS. Integrative scATAC-seq and scRNA-seq analyses map thymic iNKT cell development and identify Cbfβ for its commitment. Cell Discov. 2023 Jun 20;9(1):61. doi: 10.1038/s41421-023-00547-x. PMID: 37336875; PMCID: PMC10279728.