特異性的、受調控的RNA修飾對于正確的基因表達是重要的。轉運RNA(tRNA)富含各種化學修飾，影響其穩定性和功。tRNA第46位的7-甲基鳥苷(m7G)是一種保守修飾，可調節穩態tRNA水平以影響細胞生長。METTL1-WDR4復合體在人類中負責m7G修飾，并且METTL1-WDR4的失調與腦畸形和多發性癌癥有關7-22。在這里，作者展示了METTL1和WDR4如何協同識別RNA底物并催化甲基化。METTL1-WDR4的晶體結構和METTL1-WDR4-tRNA的低溫電鏡(Cro-em)結構表明，復合蛋白表面通過形狀互補識別tRNA肘部。METTL1-WDR4-tRNA與S-腺苷蛋氨酸(SAM)或S-腺苷同型氨酸(SAH)的低溫電鏡結構以及METTL1晶體結構通過揭示多種狀態下的活性位點，為進一步了解催化機制提供了新的見解。METTL1末端與tRNA、催化環和WDR4C端的構象變化相結合，作為m7G甲基化的激活開關。因此，作者的結構模型解釋了METTL1 N端翻譯后修飾如何調節甲基化。該研究闡明了METTL1修飾m7G的核心和調控機制，為理解其對生物學和疾病的貢獻提供了框架。該研究于2023年1月發表于《Nature》上，IF=64.8。題為“Structures and Mechanisms of tRNA Methylation by METTL1-WDR4”。

技術路線

研究內容

1.      METTL1-WDR4復合體的架構

       為了研究人METTL1甲基轉移酶的機制，作者首先用純化的重組蛋白重組了酶的活性。作者能夠分離METTL1和METTL1-WDR4復合物(圖1a)，但作者不能單獨純化WDR4，可能是因為WDR4在細菌中表達時需要METTL1才能正確折疊。對于RNA底物，作者選擇了tRNALys(tRNA-Lys-TTT-3)，因為其具有或不具有修飾或結合蛋白的穩定結構。此外，tRNALys在多種哺乳動物細胞系中被m7G46一致修飾，甲基化依賴于METTL11，12，33的存在。在體外甲基化實驗中，不含WDR4的純化METTL1不支持任何可檢測到的tRNA甲基化，但METTL1-WDR4復合物可以強有力地催化tRNALys的修飾。電泳遷移率轉移試驗(emsa)表明，METTL1本身不能很好地結合tRNA，但在WDR4的存在下，三元配合物在低納摩爾范圍內很容易觀察到親和力(圖1b，1c)。因此，作者成功地用tRNALys重建了METTL1-WDR4的甲基化活性。

       為了建立人類METTL1-WDR4復合體的三維模型，作者使用每個多肽(METTL120-265和WDR41-389)的截斷結構獲得晶體，因為較長的結構沒有結晶(圖1b)。蛋白質復合體的整體結構與酵母復合體(Trm8-Trm82)相似，但WDR4和Trm82之間觀察到更多的差異，可能是由于相對較低的序列一致性(~23%)(圖1d。WDR4的C端螺旋在作者的結構中是新解析的;由于螺旋與對稱分子進行晶體接觸，它相對于β-螺旋槳結構域的位置可能是靈活的。在形成絡合物后，METTL1和WDR4共埋藏了約1746 A2的表面積，其中包含許多疏水相互作用。極性殘基如WDR4的R170和E167以及METTL1的K143穩定了域間接觸(圖1c，1d)。這些殘基的取代降低了酶的活性，表明觀察到的分子間相互作用對METTL1-WDR4的最佳活性很重要(圖1e)。在原始侏儒癥患者的R170位點觀察到WDR4的純合突變，這表明m7G46修飾活性的降低可能表現為一種主要的大腦異常。因此，METTL1和WDR4形成了一個穩定的復合物，具有復雜的分子間相互作用，這對優化甲基轉移酶活性很重要。

       作者只能在沒有SAM或SAH的情況下結晶METTL1-WDR4復合體。為了更好地理解METTL1的催化功能，作者確定了甲基轉移酶結構域與SAM(2.25A)和SAH(1.93A)復合物的晶體結構(圖1e)。這兩個結構彼此對齊良好(RMSD，0.15A)，并且與先前沉積在蛋白質數據庫中的結構和作者的METTL1-WDR4復合物結構對齊良好(圖1f，1g)。SAM/SAH的腺嘌呤堿基與I108、M142和A141側鏈排列的疏水口袋吻合，并與N140和附近的肽主鏈形成氫鍵(圖1f)。更多的氫鍵穩定了核糖羥基與E107之間的相互作用。SAM/SAH的氨基與G84和L160的主鏈羰基形成極性接觸，羧基與T238的羥基和E240的主鏈氨基形成氫鍵。為了從生物化學角度探討催化口袋，作者引入了關鍵相互作用殘基的單丙氨酸取代，并測定了體外甲基化活性。失去觀察到的側鏈相互作用對甲基化是有害的(圖1g)。因此，通過METTL1-SAM、METTL1-SAH和METTL1-WDR4復合體的高分辨率晶體結構和定點誘變研究，作者深入了解了人類m7G寫入復合體是如何形成并與甲基供體相互作用的。

圖1 METTL1-WDR4蛋白純化及tRNA復合體重組

2. METTL1-WDR4-tRNA的低溫電鏡結構

       為了研究METTL1-WDR4復合物如何與底物tRNA結合，作者確定了METTL1-WDR4-tRNAlys復合物的低溫電鏡結構，不含輔助因子(輔因子，3.72A)、含SAM(4.05A)和含SAH(3.53A)(圖2a-2c)。與結晶實驗不同，作者可以使用全長構建METTL1，但由于聚集，作者必須截斷WDR4的C端23個殘基。為了穩定SAM結合的復合物，作者使用METTL1 D163A代替野生型來防止催化(圖1g，2b)。最終的冷凍電鏡圖顯示了清晰定義的蛋白質結構域以及結合的tRNA的構象，揭示了分子間相互作用是如何形成的，并隨著輔因子結合狀態而變化。METTL1-WDR4復合物的復合表面通過形狀和電荷互補實現特異性RNA結合。穩定的輔因子METTL1-WDR4-tRNA復合物與METT1-WDR4復合物的晶體結構保持相同的結構域間取向(RMSD，0.83A)(圖5a)。在RNA存在的情況下，作者可以在SAM結合位點附近看到更多的長環(“催化環”)，但結構變化是局部和有限的(圖5b)。與METTL1-WDR4結合的tRNALys的構象也與未結合的tRNALys(相同序列但完全修飾)和tRNALys在不相關的蛋白RNA復合物中未修飾的另一種結構相似。因此，為了形成載脂蛋白METTL1-WDR4-tRNA復合物，蛋白質和RNA底物在結合時很少發生誘導折疊，這表明不需要明顯的構象改變就可以形成穩定的特異性蛋白質-RNA復合物。

       雖然整個域架構看起來很相似，但是當SAM或SAH結合METTL1-WDR4時，會發生局部構象變化。一個明顯的變化是WDR4的C端螺旋在SAH綁定狀態下變得更加有序(圖2c)，螺旋趨于柔韌。在載脂蛋白和SAM結合狀態下僅觀察到弱螺旋密度。然而，在RNA和SAH的存在下，WDR4的C端螺旋明顯變得更加穩定，從而與tRNA和METTL1接觸，進一步加強了蛋白-RNA復合物。當所有三種低溫電鏡結構疊加時，在輔因子和SAH結合態之間觀察到最極端的構象差異，而SAM結合結構通常顯示中間狀態。METTL1錨定在WDR4上，向tRNA靠近，當與輔因子結合時，tRNA發生輕微扭曲(圖2d)；相鄰的催化環擠壓到SAM/SAH結合結構中的tRNA中(圖2e)。因此，盡管這三種狀態與tRNA在預先形成的METTL1-WDR4復合體上的對接在很大程度上相似，但輔因子結合誘導了局部構象變化。

圖2 METTL1-WDR4-tRNALys結構的低溫電鏡數據處理

3.      METTL1-WDR4的tRNA形狀識別

       在三種低溫電鏡結構中，在SAH結合狀態下觀察到最廣泛的RNA-蛋白相互作用(圖3a)。大多數依賴于輔助因子的接觸是由METTL1進行的，WDR4在所有三種結構中都與tRNA保持類似的相互作用，即使是與剛性的C端螺旋。因此，與METTL1-RNA結合界面(apo:234A2，SAM:650A2，SAH:1422A2)相比，三種狀態下WDR4-RNA結合界面的面積更恒定。METTL1-WDR4上的RNA結合表面與基本斑塊重疊良好，這與強核酸結合蛋白的預期一致(圖3b)。這些RNA結合表面的殘基在不同物種之間也相對保。

       在所有三種結構中，蛋白質-RNA的接觸都涉及tRNA核心“肘”區——D環和T環相遇的地方(圖3c)。接吻環相互作用形成了tRNA的獨特三級結構，RNA折疊由WDR4(界面I)和METTL1(界面II)形成的復合表面識別。tRNA彎頭由WDR4的M147、R165和T364以及METTL1的D32提供的疏水和pi堆疊相互作用杯化(圖3d)。WDR4的C端螺旋與d臂有額外的接觸，包括通過F365的環堆疊。此外，t臂磷酸主鏈與來自WDR4和METTL1的兩個基本側鏈簇進行了幾個有利的接觸(圖3d，e)。在大多數情況下，用單丙氨酸取代破壞磷酸相互作用并不足以引起酶活性的顯著變化，但是肘部尖端附近的R165A和M147A突變會導致甲基化顯著降低，這表明檢測tRNA肘部的獨特結構特征對于正確識別底物至關重要(圖3f)。截斷WDR4C端螺旋或在其中間引入F365A突變可減少甲基化，這表明螺旋-RNA接觸也有助于有效結合。METTL1中的堿基殘基簇屬于催化環，它改變SAM/SAH結合狀態的構象，以保持與tRNA的接觸，盡管RNA構象發生了一些扭曲(圖2g，2h)。METTL1的K167似乎對生產催化至關重要-氨基夾在處于SAHbound狀態的C48和A50的兩個磷酸鹽之間(圖3e，3f)。幾乎所有RNA與蛋白質的接觸都是靜電相互作用，這可能是因為甲基轉移酶必須通過它們的三級折疊來識別許多不同的tRNA序列。因此，METTL1-WDR4和tRNA可以通過形狀和電荷互補最低限度地形成穩定的復合物，但伴隨輔因子結合的局部重排對于優化酶活性至關重要。

圖3 METTL1-WDR4-tRNALys-SAM結構的低溫電鏡數據處理

4.      深入了解METTL1的催化機制

       在METTL1-WDR4-tRNA的載脂蛋白結構中，RNA結構與分離的tRNA41的結構非常相似。維持tRNA的自由構象與一些甲基轉移酶不同，甲基轉移酶需要撬開D環和T環的相互作用，從而導致tRNA42的部分展開。事實上，可變環只與載脂蛋白狀態的蛋白質部分相互作用，在界面處有明顯的間隙(圖4a)。為了支持G46甲基化，鳥嘌呤堿基仍然需要從埋在其他堿基之間的螺旋結構中脫離出來，并通過有利的氫鍵網絡穩定下來。作者觀察到在輔因子狀態下tRNA的構象異質性最大，特別是在靠近可變環的反密碼子臂附近。為了分離出最穩定的tRNA構象，作者不得不在最初的3D分類和改進后，在反密碼子臂附近使用掩膜來改進圖譜。觀察到的異質性表明，與METTL1-WDR4結合的tRNA會呼吸并形成替代構象，其中大多數構象并不普遍，無法重建。因此，盡管METTL1、WDR4和tRNA在這三種狀態下都能形成穩定的復合物，但在載脂蛋白狀態下，tRNA的構象更加靈活。

       在SAH結合結構中，可變環展開，將G46堿基釋放到催化口袋中，導致更密切的蛋白質-RNA接觸(圖4b)。隨著G46的翻轉，反密碼子臂也相對于tRNA的其余部分扭曲(圖4c)。為了使G46堿基的釋放在能量上有利，A21和A9環之間留下的空隙被METTL1的R24側鏈填充。扭曲的RNA構象由附近額外的堿性殘基支持，如R22(帶環的pi-pi和pi-陽離子)和K243(帶磷酸主鏈)(圖4d，4e)。在SAH結合狀態下得到的RNA構象似乎在整個顆粒中更均勻(與載脂蛋白狀態不同)，因為不需要面罩來獲得具有獨特tRNA結構的低溫電鏡圖。

       G46的N7位置距離SAM中會提供甲基的硫~5A，表明SAH結合結構更接近活性構象(圖4f)。鳥嘌呤環有三個酸性殘基(D163、D199和E240)，側鏈面向堿基的距離在4A以內(圖4e)。D163最接近激活N7，但靠近較大環的D199和E240側鏈對于鳥嘌呤去質子化以耗散甲基化獲得的正電荷也很重要。用丙氨酸取代三個酸性殘基中的任何一個都不利于甲基化活性(而附近的E239A突變的影響可以忽略不計)，這表明它們都可能對催化作用有重要貢獻(圖4g)。此外，R24在RNA螺旋中替代G46對酶活性也至關重要。因此，作者揭示了關鍵的分子元素高產m7G甲基化，R24插入tRNA莖中以幫助G46堿基翻出，甲基受體最接近D163以激活，而更多的酸性殘基-d199和e240-圍繞鳥嘌呤支持催化。

       作者研究了可變環的序列如何有助于m7G修飾，因為它在改變構象時與蛋白質產生了很大的接觸。作者對tRNALys可變環中的嘌呤引入了過渡突變，發現G45或G46突變時甲基化受到抑制，盡管G44突變對甲基化沒有顯著影響(圖4h)。為了在不破壞tRNA折疊的情況下更廣泛地搜索突變，作者使用其他人類tRNA作為底物測量甲基化活性(圖4i，圖6c)。大多數甲基化tRNA在可變環33中包含RGGUY序列。然而，在tRNAgln中重構RGGUY基序(通常折光到m7G修飾)只能部分恢復催化活性，這表明除了可變環序列外，還有其他特征涉及底物識別。在作者的低溫電鏡結構中，只有少數核堿基直接接觸METTL1-WDR4，并且它們在不同tRNA之間的差異似乎與甲基化效率的變化無關。此外，甲基化效率與EMSA測量的RNA親和力無關，這表明復合物形成后的事件可能決定了甲基化水。從這些實驗中，作者得出結論，可變環的序列和tRNA支架的其余部分對于確定m7G修飾的傾向都很重要。

圖4 METTL1-WDR4-tRNALys-SAH結構的低溫電鏡數據處理

5. METTL1 N端發揮催化作用

       當作者比較輔因子和SAH結合狀態下METTL1-WDR4-tRNA的結構時，METTL1的N附近的冷凍電鏡圖譜隨著輔因子的增加變得更加突出，使作者能夠擴展氨基酸P16-D32的模型(圖5a，5b)。這個區域在作者這里報道的其他結構中是無序的。在METTL1-WDR4-tRNASAH復合體中，METTL1的n項通過SAH和d臂之間的狹窄通道，這可能解釋了為什么肽只有在RNA和輔因子存在時才變得有序(圖5c)。

       METTL1 N-端與tRNA、催化環和WDR4的C端螺旋進行重要的特異性接觸，以協調催化袋附近的四元配合物組裝。METTL1 N項中的R22和R24已經討論了它們從螺旋堆積中釋放G46的能力(圖4f-g和5c)。SAM/SAH結合袋進一步穩定了在疏水的腺苷環結合袋中的P29對M142的n項填料。METTL1 N項也支持擠出的催化環構象——p29和M30分別與W173和K172的脂肪族部分發生疏水相互作用(圖3e和5d)。此外，N-端的H26位于靠近催化袋的位置，與D163和甲基化鳥嘌呤的主鏈在氫鍵距離內。為了獲得SAM結合結構，作者使用了催化不活躍的METTL1D163A。突變D163可能也擾亂了其穩定有序n項的能力，這可能是作者只能部分解決n項到H26的原因。由于催化環擠壓在SAM和SAH結合狀態下是相似的，因此輔因子的存在似乎足以觸發某些構象變化。綜上所述，METTL1 N-端結合輔因子與更廣泛的RNA-蛋白接觸，其中G46在催化口袋中得到了適當的結合。

       折疊的METTL1 N項也促進了WDR4C端螺旋的排序。Y20和Y21的兩個酪氨酸環定位良好，可以與R378和Y371發生pi-pi相互作用，使得C端螺旋定位更加有利(圖5e)。由于WDR4的C端螺旋也與RNA結合(圖3d)，通過METTL1 N-端固化其構象將導致更穩定的蛋白質-RNA復合物。因此，當METTL1 N端和WDR4 C端同時有序時，兩者共同提供了一個更擴展的RNA結合位點?？紤]到METTL1 N端在穩定復雜結構中發揮的多重作用，作者測試了接觸如何影響酶活性。作者發現，干擾與催化環或WDR4C端螺旋有利相互作用的突變都顯著降低了甲基化活性，突出了METTL1 N項在組織觀察到的構象變化以獲得最佳甲基化效率方面的重要性(圖5f)。因此，作者的結構和生化數據表明，METTL1 N項作為一個開關，協調對高產m7G寫入重要的多個分子事件。METTL1 N-端位于催化中心的中心，支持突出的催化環構象，穩定SAM結合袋，加強WDR4-RNA相互作用，激活G46堿基的釋放。

圖5 包含METTL1-WDR4- tRNA復合物的結構構象變化

       先前的研究表明，METTL1 N-端中的S27被AKT等關鍵信號激酶磷酸化，使該酶失活。在作者的METTL1-WDR4tRNA-SAH結構中，S27位于SAH和RNA主鏈之間，最靠近U20的磷酸基(~5A)。S27的磷酸化很可能由于空間碰撞和電荷排斥而產生碰撞(圖5g)。事實上，當作者使用METTL1S27E模擬磷酸化時，作者觀察到體外甲基化活性顯著降低(圖5h)。當作者截斷METTL1的前19個氨基酸時，有類似的酶活性損失，突出了METTL1 N-端對生產甲基化的積極貢獻。大多數tRNA對METTL1 N-端的截斷或突變很敏感。然而，敏感程度各不相同，某些tRNA(如tRNACys和tRNATrp)不受相同程度的影響，而其他tRNAVal(如tRNAVal)對n項的變化反應更靈敏?？傊?，作者的數據表明，METTL1的N端調控m7G 46甲基化活性，它通過協調SAM結合、RNA結合以及tRNA和METTL1-WDR4的構象變化而起作用，在結合輔因子和tRNA之間變得有序。同時，催化環向tRNA延伸，WDR4 C端螺旋對METTL1 N端呈剛性，以加強對外部tRNA肘部的控制。同樣的METTL1 N-端也通過取代螺旋核中的G46(通過R24)激活tRNA，釋放鳥嘌呤翻轉并插入含有SAM和三個對催化至關重要的酸性殘基的活性位點，在N7位置進行甲基化。當可變環展開時，序列rgg46y可能有助于定位修改后的堿基的最佳位置。METTL1 N端的截斷或修飾(如S27的磷酸化)抑制了催化口袋的正常組織，這為m7G修飾如何在翻譯后調節提供了結構解釋。有趣的是，METTL1 N端僅調控tRNA的一個子集。因此，通過不同背景下METTL1的分子快照，作者闡明了METTL1特異性甲基轉移酶功能和調控的機制。

實驗方法

       蛋白表達與純化；蛋白質結晶；X結晶衍射分析；RNA體外轉錄；體外甲基化試驗；電泳遷移率轉移試驗；低溫電鏡樣品制備和數據收集