非小細胞肺癌(NSCLC)是癌癥相關死亡的主要原因。免疫檢查點阻斷改善了許多非小細胞肺癌患者的生存，但大多數患者無法獲得長期益處。了解導致非小細胞肺癌免疫監視降低的因素對改善患者預后至關重要。在這里，作者發現人類非小細胞肺癌含有大量的纖維化，這與T細胞浸潤減少有關。在小鼠非小細胞肺癌模型中，纖維化的誘導導致肺癌進展加快，T細胞免疫監視功能受損，免疫檢查點阻斷效果失效。與這些變化相關，作者觀察到纖維化導致樹突狀細胞數量和功能受損，巨噬細胞表型改變，這可能導致免疫抑制。在癌癥相關成纖維細胞中，col13a1表達群體中的明顯變化表明，這些細胞產生趨化因子來招募巨噬細胞和調節性T細胞，同時限制樹突狀細胞和T細胞的招募。通過轉化生長因子-β受體信號傳導靶向纖維化克服了纖維化的影響，增強了T細胞反應，提高了免疫檢查點阻斷的療效，但僅在化療的背景下?？傊@些數據表明，非小細胞肺癌的纖維化導致免疫監視降低和對檢查點阻斷的反應性差，并突出了抗纖維化治療作為克服免疫治療耐藥性的候選策略。該文與2023年6月發布于《Science Translational Medicine》，IF=17.1。

技術路線：

主要研究結果：

1、人類非小細胞肺癌組織纖維化TME

       為了確定纖維化對非小細胞肺癌的影響，作者首先表征了人類非小細胞肺癌中反應性基質的定位和相對豐度。為了分析反應性纖維化，作者首先對NSCLC TMAs進行了膠原三色染色和α -平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的免疫組織化學(IHC)分析，α-SMA是活化成纖維細胞的標志。作者確定，與正常對照肺組織相比，NSCLC的TME中纖維化量增加，這可以通過膠原沉積增加(圖1A和B)和活化的CAFs(圖1、C和D)來定義。此外，在腫瘤細胞巢周圍經?？梢姵衫w維細胞(圖1C)?？紤]到獲取TMA的抽樣偏差，作者接下來對作者機構獲得的I期和II期非小細胞肺癌切除樣本的蘇木精和伊紅(H&E)染色切片進行了自動組織分析(圖1E和F)。作者確定，按面積計算，腫瘤相關間質平均約占切除樣本的50%，范圍從14.1到82.9%(圖1G)。這些數據表明，大多數非小細胞肺癌存在大量的腫瘤相關纖維化和結締組織增生。為了更好地了解這種腫瘤結締組織增生與腫瘤免疫的關系，作者評估了T細胞浸潤情況。作者進行了CD8和CK7雙免疫組化染色，以確定CD8+ T細胞與腫瘤細胞的接近程度，并將其與來自每個樣本的基質數量進行比較。作者發現基質的數量，無論是以基質面積還是膠原密度計算，都與CK7+腫瘤細胞50 μm內CD8+ T細胞數量的減少相關(圖1,H至J)。這些數據表明，腫瘤相關纖維化的增加可能會影響非小細胞肺癌的T細胞數量。

圖1、人類非小細胞肺癌組織存在反應性纖維化

2、反應性纖維化驅動肺腺癌進展

       為了確定纖維化在腫瘤免疫監測和腫瘤進展中的作用，作者評估了幾種非小細胞肺癌小鼠模型的纖維化。其中包括常用的基因工程小鼠模型(GEMMs) KrasLSL-G12D;Trp53fl/fl (KPL)小鼠，它們被給予氣管內單次腺病毒- Cre重組酶誘導轉化。作者還使用了Lewis肺癌(LLC)的原位模型，以及在氣管內腺病毒- Cre重組酶(KPL86)治療9個月后，從Trp53雜合null (KPL GEMM)的肺中提取的細胞系。與人類非小細胞肺癌相比，在所有這些模型中，作者發現膠原沉積最少（圖2A-C）。為了模擬反應性纖維化可能對腫瘤進展和免疫的影響，作者使用了兩個實驗系統。其中包括氣管內給藥博來霉素(Bleo)或異硫氰酸熒光素(FITC)。Bleo誘導肺泡上皮細胞損傷，導致自由基和氧化應激增加，最終在2 - 4周內導致炎癥和反應性纖維化。FITC導致肺泡和血管損傷加重，在2 ~ 3周內導致纖維化。Bleo或FITC膠原蛋白增加,所評估的三色的染色,淀積瘤旁和肺實質,以及腫瘤相關αSMA +三個模型的成纖維細胞(圖2A-C)。通過流式細胞術，作者觀察到在纖維化環境中CD45 - EpCAM - CD31 - CAFs的數量增加。在所有評估的模型中，Bleo或FITC誘導反應性纖維化導致腫瘤進展加快，包括KPL GEMMs和原位LLC和KPL86模型(圖2D-I)?？傊?，這些數據表明反應性纖維化可能是腫瘤進展的強大驅動因素。

圖2、反應性纖維化促進非小細胞肺癌小鼠模型的癌癥進展

3、纖維化損害免疫監視和T細胞介導的腫瘤控制

       鑒于T細胞介導的腫瘤控制的重要性，以及作者在人類非小細胞肺癌中觀察到纖維化與T細胞負相關，作者試圖確定纖維化是否會損害T細胞免疫。免疫組化對T細胞的分析顯示，來自KPL GEMMs以及LLC和KPL86原位模型的bleo誘導的纖維化腫瘤中CD8+ T細胞數量減少(圖3A-D)。同樣，FITC誘導的反應性纖維化也減少了KPL GEMMs腫瘤內CD8+ T細胞的數量。流式細胞術分析發現，纖維化小鼠的PD-1+ CD8+ T細胞和Foxp3+ CD4+ treg增加。為了評估纖維化對腫瘤控制的作用是否可能是T細胞介導的，在原位LLC模型中，無論是否存在Bleo, CD4+和CD8+ T細胞都被耗盡。在沒有Bleo的情況下，作者發現T細胞的耗竭導致腫瘤負荷的增加，這表明在該模型中T細胞能夠抑制腫瘤的生長(圖3E)。相反，在Bleo存在的情況下，作者發現T細胞的消耗并沒有進一步增加腫瘤負荷(圖3E)。這些數據表明，纖維化至少在一定程度上通過損害T細胞來促進腫瘤生長。為了評估纖維化對免疫監測的影響，作者使用了KPL GEMMs，這些GEMMs在Cre-recombinase的控制下，也表達與綠色熒光蛋白(GFP) (KPLOG)融合的卵清蛋白(OVA)(圖3F)。在由此產生的腫瘤中，作者觀察到與KPL小鼠相比，KPLOG小鼠的CD8+ T細胞顯著(P = 0.02)增加，這表明誘導了T細胞免疫(圖3G和H)。在該模型中，與免疫監視在腫瘤控制中的作用一致，表達OG抗原的KPLOG小鼠衍生的腫瘤比OG?KPL小鼠的腫瘤小(圖3I和J)。OG新抗原表達對免疫介導的腫瘤控制的影響被取消，OG+和OG?KPL小鼠的腫瘤負荷同樣加速(圖3I和J)。這些數據表明，纖維化損害了新抗原驅動的T細胞介導的腫瘤控制。與作者之前的觀察結果一致，纖維化減少了KPLOG小鼠肺和腫瘤內CD8+ T細胞的數量(圖3K和L)，同時增加了Foxp3+ Tregs。對ova特異性葡聚糖+ T細胞的流式細胞術顯示，纖維化肺(圖3M)和KPLOG GEMMs的引流淋巴結中抗原特異性CD8+ T細胞減少(圖3N)。總之，這些數據表明，在纖維化的情況下，T細胞啟動受損。當FITC誘導纖維化時，作者觀察到對腫瘤負荷和CD8+ T細胞定位的類似影響，證實這是一種纖維化介導的對T細胞介導的腫瘤控制的損害，而不是對T細胞功能的bleo特異性影響(圖30-R)。

圖3、反應性纖維化損害非小細胞肺癌模型的免疫監視

4、在非小細胞肺癌模型中，纖維化損害檢查點阻斷療效

       鑒于作者觀察到抗原特異性T細胞減少和免疫監視，作者下一步試圖確定纖維化是否會損害免疫檢查點抑制劑的功效。為了評估這一點，作者評估了不同治療環境下KPL86原位荷瘤小鼠的腫瘤負荷。如上所述,誘導纖維化導致腫瘤負荷的增加(圖4A和B)。與標準化療治療非小細胞肺癌(卡鉑和培美曲塞)導致相當于減少腫瘤負荷不管時間(圖4A和B)。然而,在纖維化后,檢查點阻斷與化療相比沒有額外的益處，這表明纖維化TME取消了檢查點阻斷的功效(圖4A和B)。這些數據表明，纖維化TME中T細胞免疫的改變限制了免疫檢查點阻斷的益處。

圖4、反應性纖維化損害對免疫檢查點封鎖的反應

5、肺纖維化導致骨髓反應改變

       為了更好地理解纖維化如何導致免疫抑制性TME，作者首先分析了腫瘤浸潤的骨髓細胞。在肺中，巨噬細胞和常規樹突狀細胞(cDC)是抗原呈遞的主要介質，這些細胞的功能障礙導致免疫監視改變。因此，作者對有無實驗性纖維化的荷瘤小鼠的肺髓系室進行了評估。在KPL GEMMs和LLC原位模型的肺腫瘤中，作者發現實驗性纖維化增加了總巨噬細胞和CD206+巨噬細胞的數量，但沒有改變Ly6G+中性粒細胞的數量(圖5A和B)。為了更好地表征這些巨噬細胞的定位，作者對F4/80進行了免疫組化染色，結果顯示實驗性纖維化誘導腫瘤巢和周圍肺實質中巨噬細胞浸潤增加(圖5C)。作者接下來進行了CyTOF分析。與流式細胞術結果一致，作者觀察到間質和肺泡巨噬細胞中CD206的表達增加(圖5D-F)。作者還觀察到，纖維化肺TME的兩個巨噬細胞亞群表達的主要組織相容性復合體II (MHC-II)減少，但MHC-I和PD-L1增加，這表明表型被激活但可能被抑制(圖5E-F)。這些數據表明，纖維化肺TME不僅導致巨噬細胞數量增加，而且改變其表型。接下來，作者通過單細胞RNA測序(scRNA-seq)評估肺巨噬細胞 (圖5G)。這些亞群中轉錄變化最明顯的是肺泡巨噬細胞(圖5G)。與先前的數據一致，纖維化肺的肺泡巨噬細胞高度表達Mrc1 (CD206)和Arg1(精氨酸酶1。接下來，作者鑒定了差異表達基因(DEGs)并進行了基因集富集分析(GSEA)。與停留在纖維化TME一致，作者觀察到來自bleo啟動肺的肺泡巨噬細胞中整合素和SMAD2/3信號的增加。作者還發現纖維化肺的肺泡巨噬細胞Ccl3、Ccl4和Cxcl9表達降低，但Ccl5、Ccl6、Ccl9和Ccl17表達升高(圖5H)。綜上所述，這些數據表明纖維化導致巨噬細胞表型的改變，從而影響細胞毒性T細胞、Treg和cDC的浸潤和功能。由于傳統的流式細胞術、CyTOF和scRNA-seq方法分析了整個肺，包括腫瘤和非腫瘤區域，作者接下來尋求特異性地詢問腫瘤相互作用的巨噬細胞。為了解決這個問題，作者使用表達可溶性mCherry (mCher+)的KPL86腫瘤細胞。該系統允許表征存在于腫瘤巢內的細胞，這些細胞將從周圍環境中吸收mCher，而那些不存在于腫瘤巢中的細胞將保持mCher陰性(mCher -)(圖5I)。使用該系統，作者發現來自纖維化肺的腫瘤相互作用肺泡巨噬細胞的MHC-I、PD-L1、PD-L2和T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域-3 (Tim3)的表達增加(圖5I)。在mCher -肺泡巨噬細胞中未觀察到這些變化。總之，這些數據表明腫瘤相互作用巨噬細胞可能有助于T細胞功能障礙。接下來，作者試圖確定巨噬細胞亞群在纖維化加速腫瘤進展中的作用。為了消耗肺泡巨噬細胞，作者采用氣管內氯膦酸鈉脂質體;為了消耗間質巨噬細胞，作者采用腹腔內抗集落刺激因子1 (CSF1)抗體(IP αCSF1)。作者觀察到，在氯膦酸鹽處理的小鼠中，肺泡巨噬細胞顯著(P = 0.0001)減少，但間質巨噬細胞沒有減少，而IP αCSF1對肺泡巨噬細胞沒有影響，但顯著(P < 0.00001)減少了間質巨噬細胞的數量。導致纖維化肺中腫瘤負荷顯著(P = 0.01)減少，但在沒有實驗性纖維化的情況下不影響腫瘤進展(圖5J)。與腫瘤進展的變化類似，肺泡巨噬細胞的消耗恢復了CD8+ T細胞和Clec9a+ cDC浸潤，與非纖維化肺相當(圖5K和L)。這些數據表明，纖維化誘導的肺泡巨噬細胞的變化在驅動腫瘤進展和抑制腫瘤免疫方面特別重要。鑒于cDC在啟動抗腫瘤免疫應答中的作用，作者進一步對其進行了表征。在KPL GEMMs中，作者觀察到Bleo誘導小鼠肺TME中CD103+ cDC1s和CD11b+ cDC2s的表達減少(圖5M)。CyTOF表征顯示MHC-I和MHC-II以及cDC1s中的共刺激分子CD80和CD86的表達減少(圖5N)。作者也發現了類似的cDC2s變化。scRNA-seq分析顯示，來自纖維化肺的cDC1s中的toll樣受體、白細胞介素-6 (IL-6)、IL-12和CD40信號通路特征減少，這些細胞也表現出同種異體移植排斥反應和炎癥反應減少。接下來，作者使用可溶性mCher系統表征了腫瘤相互作用和非腫瘤相互作用的cdc。作者發現實驗性纖維化導致mCher+ cDC1上MHC-II、CD80和CD86的表達降低，而mCher - cDC1s上這些表達沒有變化(圖50)。免疫檢查點Tim3的表達增加，而參與抗原攝取的Tim4在纖維化肺腫瘤的mCher+ cDC1s上表達減少(圖50)。綜上所述，這些數據表明纖維化會損害cDC1向TME的浸潤，并可能損害肺腫瘤內cDC1的功能。

圖5、反應性纖維化改變骨髓反應

6、成纖維細胞表型的改變有助于非小細胞肺癌的免疫抑制TME

       作者之前觀察到，與健康組織相比，非小細胞肺癌中CAF的數量增加。為了進一步表征這些細胞，作者用流式細胞術分析了PBS或Bleo處理的小鼠肺，再次發現纖維化肺中CD45 - EpCAM - CD31 - CAFs數量增加(圖6A)。當作者分析特異性CAFs的標志物時，作者發現成纖維細胞活化蛋白α (FAP+)和CD90+ (Thy-1) CAFs在纖維化肺中增加(圖6B和C)。CD90+和FAP+ CAFs與NSCLC患者的生存率降低有關?？傊?，這些數據表明，在這些肺癌相關纖維化模型中，總CAF增加，但CAF表型有一些特異性改變。最近，使用scRNA-seq更好地闡明了NSCLC中CAFs的異質性。為了更好地了解纖維化腫瘤模型中CAFs的分子和功能異質性，作者從經過和未經過Bleo處理的KPL GEMM荷瘤小鼠中分離了CD45 - EpCAM - CD31 -細胞，并進行了scRNA測序。對CAFs進行UMAP分析，發現10個簇均表達關鍵識別基因，如Col1a1。作者分析了這些標記的10個集群，將它們分為三個不同的集群。在肺間充質細胞中鑒定出表達acta2的[肌成纖維細胞(Myofib)]、表達col14a1的(Col14)和表達col13a1的(Col13)成纖維細胞(圖6D)。將pbs處理與bleo處理的腫瘤肺進行比較，發現Col13+成纖維細胞和Myofib相對增加，Col14+成纖維細胞減少(圖6E)， Col13+成纖維細胞轉錄轉移(圖6F)。特定的成纖維細胞亞群可能在TME內促進免疫抑制中發揮作用。鑒于在誘導纖維化后在Col13成纖維細胞群體中觀察到的改變，作者將重點放在這一群體上，并詢問它們是否表現出可能影響TME免疫組成的改變的趨化因子或細胞因子譜。差異基因表達分析發現，Ccl6、Cxcl12和Cxcl16在成纖維細胞中表達上調，而這些細胞先前被認為與bleo誘導的肺纖維化有關(圖6G)。作者還發現了幾種趨化因子的變化，表明纖維化誘導了免疫抑制微環境。例如，與觀察到的巨噬細胞和Treg的變化一致，作者注意到與骨髓細胞組織浸潤(Ccl4和Ccl9)和Treg募集(Cxcl12)相關的趨化因子增加(圖6G)。Ccl19，一種cDC浸潤的化學引誘劑，在從纖維化肺分離的Col13成纖維細胞中減少。參與細胞毒性T細胞募集的趨化因子，如Cxcl10在纖維化模型中減少，表明CAF的變化可能導致免疫抑制(圖6G)。接下來，作者試圖測試來自bleo誘導的纖維化肺的成纖維細胞是否可以調節巨噬細胞表型。為了實現這一目標，作者使用Transwell系統將來自對照或暴露于藍光下的肺的原代成纖維細胞與骨髓源性巨噬細胞(bmdm)共培養。作者發現，與對照組相比，來自纖維化肺的成纖維細胞誘導Arg1、Mrc1 (CD206)和Il6的表達更高。這些數據表明，來自纖維化肺的活化成纖維細胞可能通過調節巨噬細胞來促進免疫抑制。為了在體內測試活化的成纖維細胞的影響，作者使用了血小板衍生生長因子受體α+ (PDGFRα+)細胞的遺傳耗損，因為PDGFRα+在Col13+和Col14+成纖維細胞中表達，但在α sma +成纖維細胞中不表達。將Pdgfratm1.1(cre/ERT2)(PDGFRα- creert2)小鼠與lox-stop-lox (LSL) -白喉毒素受體(DTR)小鼠雜交，可誘導DTR在PDGFRα+細胞上表達。連續5天服用他莫昔芬，然后單劑量白破毒素導致PDGFRα細胞的有效耗竭，而αSMA細胞沒有觀察到變化(圖6H和I)。在耗竭PDGFRα+細胞(包括Col13+成纖維細胞)后，Bleo處理小鼠的腫瘤負荷明顯減輕(圖6J)。流式細胞術顯示肺泡巨噬細胞減少(圖6K)，瘤內CD8+ T細胞數量增加(圖6L)。這表明PDGFRα+成纖維細胞，包括Col13+成纖維細胞，在肺腫瘤纖維化的免疫浸潤改變中發揮作用。與已知的bleo誘導的肺纖維化一致，過度代表分析發現，與pbs處理的Col13+成纖維細胞相比，bleo處理的TGFβ反應途徑增加(圖5)。盡管幾乎所有的CAF亞群都有表達TGFβ應答信號的細胞，但Col13+成纖維細胞有一個大的陽性信號，這表明這是表達TGFβ的主要CAF亞群。作者通過免疫組化(IHC)證實bleo處理肺中tgf - β升高(圖5p)。總之，這些數據表明，除了推動特定CAF亞群的增加外，纖維化還將其表型轉向更具免疫抑制性。

圖6、CAF的表型改變改變了纖維化TME中免疫細胞的募集，并增強了TGFβ的表達

7、靶向轉化生長因子β受體-1 (TGFβRI)信號僅在聯合化療時才能恢復免疫檢查點療效

       TGFβ在肺纖維化的發病機制中得到了很好的證實，作者證實，通過氣管內遞送表達TGFβ1血清型6的腺相關病毒(AAV)， TGFβ在肺中的表達可以通過膠原沉積來誘導纖維化。此外，肺AAV-TGFβ1表達導致腫瘤負荷和CD206巨噬細胞浸潤增加，腫瘤內CD8+ T細胞減少與Bleo或fitc誘導的實驗性纖維化模型相當。接下來，作者試圖確定作者是否可以逆轉在作者的模型中觀察到的肺纖維化的致瘤表型。為此，作者評估了幾種目前用于治療人類肺纖維化的藥物，包括尼達尼布和吡非尼酮。然而，在腫瘤相關纖維化建立后給予這些藥物，這些藥物未能改變膠原- 1沉積的數量(圖7A)。由于作者已經觀察到Bleo暴露的成纖維細胞中TGFβ信號反應增加，并且肺部TGFβ過表達重現了在Bleo或FITC治療的纖維化肺中觀察到的表型，因此作者試圖使用一種工具化合物TGFβRI抑制劑Ly364947靶向這一途徑。作者發現，在誘導纖維化后給予Ly364947，能夠大部分減少肺內I型膠原的數量(圖7A)。此外，雖然纖維化顯著(P = 0.017)減少了CD8+ T細胞的數量，但Ly364947治療使肺CD8+ T細胞數量恢復到基線水平(圖7B)。相比之下，尼達尼布和吡非尼酮的CD8+ T細胞頻率與纖維化肺相似(圖7B)。與這一發現一致的是，與對照、尼達尼布或吡非尼酮處理的小鼠相比，Ly364947治療荷瘤小鼠對纖維化肺腫瘤負荷的影響不大(圖7C)。為了確定TGFβRI抑制劑Ly364947是否能夠與非小細胞肺癌的標準治療協同作用，作者用以下治療方案治療纖維化、腫瘤肺小鼠:Ly364947單獨治療、Ly364947聯合抗PD-1免疫球蛋白G (IgG) (PD-1)、卡鉑+培美曲塞聯合PD-1 (Chemo/PD-1)或Chemo/PD-1 + Ly364947。單獨使用Ly364947治療可使腫瘤負荷略有下降(圖7D和E)。與對照相比，Ly364947與PD-1或Chemo聯合使用均未能改善腫瘤負荷(圖7D和E)。與對照組相比，Chemo/PD-1顯著(P = 0.0002)降低了腫瘤負荷(圖7D和E)。然而，將Chemo/PD-1與Ly364947聯合使用可將腫瘤負荷降低至接近基線(無纖維化)，并恢復腫瘤浸潤的CD8+ T細胞，這表明添加Ly364947可增強Chemo/PD-1的療效(圖7D和E)，這是非小細胞肺癌患者的標準治療方法。作者只觀察到在實驗性纖維化存在的情況下，將TGFβ r1抑制加入Chemo/PD-1對腫瘤負荷和CD8+ T細胞和cle9α + cDC1浸潤的益處，這表明在沒有纖維化相關的TGFβ的情況下，信號傳導可能沒有達到臨界閾值(圖7F至H)。為了探索這些發現在人類樣本中的實用性，作者分析了POPLAR和OAK臨床試驗中使用atezolizumab治療轉移性NSCLC患者的數據。作者發現，在Col13+ CAFs中觀察到的TGFβ反應特征與這些患者的總生存率提高相關(圖7I)。此外，來自Col13 CAFs的前50個基因的基因標記與M2巨噬細胞增加(圖7J)、M1巨噬細胞減少(圖7K)、樹突狀細胞活化(圖7L)和CD8+ T細胞相關?？傊@些數據表明，這些TME元素在接受免疫檢查點阻斷的患者中可能是重要的。

圖7、靶向TGFβRI信號通路可提高化療聯合檢查點阻斷的療效。

結論

       總之，這些數據表明，在非小細胞肺癌中，纖維化通過降低抗腫瘤免疫導致腫瘤進展。纖維化誘導成纖維細胞和腫瘤相關巨噬細胞的改變，從而損害樹突狀細胞和T細胞反應，最終降低了最佳檢查點治療效果所必需的抗腫瘤免疫反應。因此，針對這種纖維化TME的治療策略可以改善人類NSCLC對化療和免疫治療的反應。

實驗方法

       流式細胞術、質譜流式細胞技術、單細胞測序、IHC

參考文獻

       Herzog BH, Baer JM, Borcherding N, Kingston NL, Belle JI, Knolhoff BL, Hogg GD, Ahmad F, Kang LI, Petrone J, Lin CY, Govindan R, DeNardo DG. Tumor-associated fibrosis impairs immune surveillance and response to immune checkpoint blockade in non-small cell lung cancer. Sci Transl Med. 2023 Jun 7;15(699):eadh8005. doi: 10.1126/scitranslmed.adh8005. Epub 2023 Jun 7. PMID: 37285399.