使用免疫檢查點(diǎn)阻斷劑（ICBs）的免疫治療在多種實(shí)體瘤（包括黑色素瘤）的治療中顯著提高了CD8 T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。然而仍有相當(dāng)數(shù)量的黑色素瘤患者對(duì)免疫治療無(wú)效。黑色素瘤是一種典型的免疫原性腫瘤，可以通過(guò)多種癌細(xì)胞內(nèi)在和外在機(jī)制來(lái)維持深刻的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）。闡明促進(jìn)免疫抑制TME的分子機(jī)制對(duì)于克服黑色素瘤免疫治療的耐藥性具有重要的臨床意義。與大多數(shù)處于靜止?fàn)顟B(tài)的健康組織內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）相比，TECs不斷暴露于導(dǎo)致功能和結(jié)構(gòu)異常的血管生成線(xiàn)索。晚期腫瘤中異常血管生成導(dǎo)致的血管重塑通過(guò)增強(qiáng)TECs的免疫抑制特性來(lái)對(duì)T細(xì)胞浸潤(rùn)產(chǎn)生屏障。闡明能夠?qū)?span>TEC免疫抑制特性的關(guān)鍵機(jī)制，或闡明其炎癥狀態(tài)，對(duì)于充分釋放抗腫瘤免疫應(yīng)答至關(guān)重要。自噬是腫瘤和其他炎癥狀態(tài)中免疫和炎癥微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子。在宿主組織中自噬的喪失會(huì)誘導(dǎo)系統(tǒng)性和組織特異性的代謝重編程，從而有利于抗腫瘤免疫。然而自噬如何調(diào)節(jié)與免疫細(xì)胞交界的血管的免疫調(diào)節(jié)功能尚不清楚。與TEC相關(guān)的自噬在何種程度上影響炎癥、免疫監(jiān)視和對(duì)ICBs的反應(yīng)仍然未知。該研究發(fā)表在《EMBO Molecular Medicine》，IF：11.1。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1. 內(nèi)皮細(xì)胞自噬缺失可改善黑色素瘤的免疫監(jiān)視

        為了揭示內(nèi)皮細(xì)胞自噬在調(diào)節(jié)黑色素瘤免疫監(jiān)視中的作用，研究者將可誘導(dǎo)的PDGFb-creERT2Rosa26tdTomato/tdTomato細(xì)胞系與ATG5fl/fl小鼠雜交，在他莫昔芬給藥后從血液內(nèi)皮細(xì)胞中刪除必需的自噬基因Atg5（即ATG5BECKO）。研究者在WT和Atg5BECKO小鼠中比較了皮下移植的小鼠B16-F10黑色素瘤和免疫原性較高的Hcmel12黑色素瘤的生長(zhǎng)情況，Hcmel12是在Hgf-Cdk4R24C小鼠中連續(xù)移植UV誘導(dǎo)的原發(fā)性黑色素瘤。在兩個(gè)同系模型中，在血液內(nèi)皮細(xì)胞中敲除ATG5使腫瘤負(fù)荷達(dá)到相似的降幅（圖1A-D）。

        由于典型自噬蛋白ATG5/ATG12是調(diào)節(jié)發(fā)育中的自噬體的多聚體泛素樣結(jié)合復(fù)合物的一部分，研究者推斷ATG12缺失應(yīng)該是TEC中ATG5缺失導(dǎo)致的功能性上位性改變。ATG9是一種被ULK1磷酸化的跨膜蛋白，并被招募到PI3KC3自噬起始機(jī)制復(fù)合體，該復(fù)合體控制自噬體形成的第一步。此外，雖然Atg5和Atg12都參與了與LC3相關(guān)的吞噬作用，但ULK1復(fù)合體的成分似乎并未參與其中。在比較接種B16-F10或免疫原性YUMMER 1.7黑色素瘤細(xì)胞的野生型和Atg12ECKO或Atg9ECKO小鼠時(shí)，研究者觀察到腫瘤負(fù)荷的類(lèi)似表型差異（圖1E-H）。

        在B16-F10和YUMMER 1.7腫瘤中，TEC-自噬缺失均增加了CD31+ TEC周?chē)?span>CD3+ T淋巴細(xì)胞的存在，尤其是在血管化程度較高的腫瘤邊緣（圖1I，J），這提示無(wú)論使用的黑色素瘤模型的免疫原性如何，TEC-自噬的缺失均增加了吸引和募集T細(xì)胞的能力。

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞自噬的遺傳缺失會(huì)降低黑色素瘤的生長(zhǎng)

        然后，研究者通過(guò)FACs分析來(lái)自B16-F10 WT和Atg5BECKO小鼠的TIL中CD8+和CD4+ T細(xì)胞的存在。與WT小鼠的黑色素瘤相比，Atg5BECKO小鼠的黑色素瘤顯示出CD8+ T和CD4+ T細(xì)胞數(shù)量增加（圖2A，B），并且含有關(guān)鍵效應(yīng)分子顆粒酶B（GrzB）表達(dá)較高的CD8+ T細(xì)胞（圖2A）。攜帶黑色素瘤的Atg5BECKO小鼠也表現(xiàn)出免疫抑制性T調(diào)節(jié)性細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比例下降，這是TME免疫抑制狀態(tài)減弱的一個(gè)指標(biāo)（圖2C）。

        為了進(jìn)一步了解活化的TIL群體，研究者分析了前體耗竭的CD8+ T細(xì)胞，其標(biāo)志是TCF1和PD1的聯(lián)合表達(dá)，以及缺乏TIM3表達(dá)，以及其后代的終末耗竭效應(yīng)因子PD1+ CD8+ T細(xì)胞，定義為GrzB增加和TIM3水平高，但缺乏TCF1表達(dá)。在WT和Atg5BECKO小鼠中，兩個(gè)種群保持相似（圖2D）。然而，與WT小鼠相比，來(lái)自Atg5BECKO的最終耗竭效應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生的GrzB量較高（圖2E）。

        然后，研究者詢(xún)問(wèn)了在ATG5BECKO小鼠中，CD8+ T細(xì)胞增加和腫瘤生長(zhǎng)減少之間是否存在因果關(guān)系。研究者通過(guò)注射αCD8+抗體去除CD8+ T細(xì)胞，并在WT和Atg5BECKO小鼠中檢測(cè)了腫瘤生長(zhǎng)（圖2F）。去除CD8+ T細(xì)胞未顯著影響WT小鼠中的B16-F10生長(zhǎng)，但逆轉(zhuǎn)了Atg5BECKO小鼠中對(duì)腫瘤負(fù)荷和生存期的有益作用（圖2G，H），因此在功能上提示CD8+T細(xì)胞參與延遲的腫瘤生長(zhǎng)表型。

        總之，這些數(shù)據(jù)表明，TECs中典型自噬基因的缺失通過(guò)增加表達(dá)GrzB的效應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞的頻率來(lái)抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)和具有免疫抑制性的TME。

圖2 腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中Atg5的缺失促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)

2. 自噬促進(jìn)TEC的免疫耐受狀態(tài)

        接下來(lái)，研究者探討了自噬如何調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞內(nèi)流和活性，重點(diǎn)關(guān)注調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的趨化因子、細(xì)胞因子和黏附分子。自噬不僅通過(guò)蛋白質(zhì)降解發(fā)揮直接作用，還調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳程序，研究者首先對(duì)來(lái)自B16-F10腫瘤的FAC分選的Atg5精通和Atg5缺陷的CD45-Ter119-CD31+TEC進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜分析，使用Nanostring技術(shù)對(duì)涉及癌癥免疫調(diào)節(jié)的770個(gè)基因進(jìn)行了分析（圖3A）。在研究者的數(shù)據(jù)集中，最主要的特征與炎癥反應(yīng)相關(guān)（圖3B）。此外，對(duì)Log2FC≥0.7且P<0.05的差異表達(dá)（DE）基因所做的分析表明，在Atg5BECKO TEC中，編碼具有免疫細(xì)胞相互作用活性的表面炎癥蛋白和細(xì)胞因子/趨化因子的基因顯著表達(dá)，而這些是炎癥TEC表型的特征（圖3C）。與此同時(shí)，與NF-κB通路相關(guān)的因子和各種EC黏附分子的基因表達(dá)在Atg5BECKO小鼠TECs中顯著上調(diào)。后者包括VCAM1，ICAM1，SELE和SELP，它們?cè)诮Y(jié)合T細(xì)胞表面配體和增加T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)中具有確定的作用，以及在內(nèi)皮細(xì)胞中具有趨化和黏附功能的細(xì)胞因子和趨化因子，如IL6、CX3CL1/fractalkine、CXCL2、CXCL1和非經(jīng)典NF-κB通路的介質(zhì)RELB（圖3C）。另外一組用于抗病毒/1型干擾素（IFN）應(yīng)答的DE基因包括IFIH1、IRF1、IRF7、TLR4以及抗原呈遞機(jī)制H2-K1、H2-T23和H2-D1的元件，這提示Atg5BECKO小鼠的TECs獲得了改善的免疫調(diào)節(jié)功能，包括維持T細(xì)胞功能的能力（圖3C）。基因集富集分析證實(shí)，與來(lái)自WT小鼠的TECs相比，來(lái)自Atg5BECKO小鼠的TECs在參與炎癥反應(yīng)和IFN信號(hào)通路的基因集中表現(xiàn)出穩(wěn)健的富集（圖3B）。因此，ATG5敲除引起TEC中控制淋巴細(xì)胞黏附和功能的趨化因子和分子的表達(dá)。

        然后，研究者在選定的免疫調(diào)節(jié)標(biāo)志物的蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。與WT相比，來(lái)自Atg5BECKO小鼠的TECs顯示VCAM1、ICAM1和STING（抗病毒/1型干擾素應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)因子）水平顯著增加（圖3D）。與此同時(shí)，Atg5BECKO小鼠TECs的VCAM1、ICAM1、MHCⅰ類(lèi)和MHCⅱ類(lèi)的表面表達(dá)以及IFNβ（STING通路的下游效應(yīng)因子）的胞內(nèi)表達(dá)均升高（圖3E）。因此，在各種黑色素瘤模型中，自噬阻斷可促進(jìn)TEC炎癥。

        接下來(lái)，研究者試圖通過(guò)分析公開(kāi)獲得的單細(xì)胞RNA-seq癌癥圖譜中的ECs表型特征，將研究者的小鼠mRNA譜與人類(lèi)TECs（huTECs）進(jìn)行更廣泛的背景分析。為了增加罕見(jiàn)huTEC亞型的覆蓋率，研究者匯總了來(lái)自不同活檢部位（原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移和鄰近非腫瘤組織樣本）的非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、高級(jí)別漿液性卵巢癌和結(jié)直腸癌的EC scRNAseq數(shù)據(jù)。從總共7573個(gè)高質(zhì)量TEC開(kāi)始，研究者對(duì)這些腫瘤進(jìn)行了聚類(lèi)分析。研究者驗(yàn)證了來(lái)自納米串分析的“炎癥”基因標(biāo)簽包含在小鼠和人類(lèi)之間保守的基因，并使用該內(nèi)部生成的標(biāo)簽（稱(chēng)為muTEC-DE）和反應(yīng)組-巨自噬標(biāo)簽進(jìn)行進(jìn)一步分析。值得注意的是，以muTEC-DE標(biāo)簽表達(dá)最高為標(biāo)志的IFN huTEC亞群在自噬標(biāo)簽中的富集程度最低（圖3F），這提示，特別是免疫調(diào)節(jié)功能更明顯的亞型同時(shí)顯示出自噬基因的低表達(dá)水平。

        研究者進(jìn)一步在各種癌癥類(lèi)型的原發(fā)腫瘤huTEC內(nèi)檢驗(yàn)了muTEC-DE和自噬標(biāo)簽之間的關(guān)聯(lián)。值得注意的是，除了非小細(xì)胞肺癌之外，研究者在分析的所有其他癌癥類(lèi)型中觀察到這些標(biāo)簽之間存在顯著的負(fù)相關(guān)，盡管在乳腺癌中這種負(fù)相關(guān)程度有所降低（圖3G）。此外，huTECs中muTEC-DE標(biāo)簽的富集與T細(xì)胞內(nèi)測(cè)定的CD8+反應(yīng)性T細(xì)胞標(biāo)簽的表達(dá)呈正相關(guān)（圖3H）。

        綜上所述，這些觀察結(jié)果提示，無(wú)論物種或腫瘤類(lèi)型，自噬能力低的TECs均具有增強(qiáng)的免疫支持功能。

圖3 自噬抑制腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的炎性表型

3. 自噬可減弱內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB和cGAS的炎癥軸

        接下來(lái)，研究者的目標(biāo)是確定自噬抑制支持EC炎癥表型的潛在機(jī)制。研究者評(píng)估了培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是否可以重現(xiàn)在小鼠中觀察到的自噬遺傳缺失的影響。與對(duì)照內(nèi)皮（Ctr）相比，Atg5KO內(nèi)皮中一組基本相似的炎癥基因（例如SELE、VCAM1和ICAM1）和趨化因子（例如CX3CL1、CXCL10）的表達(dá)增強(qiáng)，這是在對(duì)從Atg5BECKO小鼠分離出的muTEC進(jìn)行的納米串分析中觀察到的結(jié)果（圖4A-E）。炎癥基因表達(dá)譜程度的差異（圖4A-E）可能可以通過(guò)這些細(xì)胞中ULK1/2的急性抑制而非ATG5的慢性缺失來(lái)解釋。Atg5KO細(xì)胞中VCAM1的表面表達(dá)增加通過(guò)FACs進(jìn)一步驗(yàn)證（圖4F）。

        考慮到體內(nèi)和體外表型的相似性，研究者使用培養(yǎng)的自噬缺失的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)研究加劇炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的分子通路。研究者專(zhuān)注于STING和NF-κB信號(hào)通路，因?yàn)橐阎?span>STING激活可通過(guò)協(xié)同調(diào)節(jié)I型IFN和NF-κB激活來(lái)促進(jìn)抗腫瘤免疫，而在攜帶黑色素瘤的Atg5BECKO小鼠的muTEC中增強(qiáng)（圖3C，D）。此外，雖然已知自噬可調(diào)節(jié)STING和NF-κB通路，但在內(nèi)皮細(xì)胞中，去除STING可改善T細(xì)胞在TNF誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的募集。

        在經(jīng)典的STING激活途徑中，cGAS與胞質(zhì)內(nèi)的dsDNA結(jié)合并催化cGAMP的合成。cGAMP與ER相關(guān)STING的結(jié)合觸發(fā)其寡聚化，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）出口/釋放到ER-高爾基中間室，其中寡聚化的STING介導(dǎo)了TBK1的激活/磷酸化。這進(jìn)而導(dǎo)致干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄和NF-κB的激活。信號(hào)停止是通過(guò)將STING從后高爾基體販運(yùn)到溶酶體來(lái)協(xié)調(diào)的，在溶酶體中，STING被降解。

        研究者首先測(cè)量了自噬/溶酶體降解途徑的干擾對(duì)STING運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)的影響。在靜息條件下，通過(guò)ATG5KO阻斷自噬（圖4G）導(dǎo)致STING的單體和二聚體/寡聚體形式逐漸增加，這是通過(guò)在非變性條件下的免疫印跡發(fā)現(xiàn)的。同樣，在ATG5KO ECs中，STING與LMAN1的共定位增加，這與TBK1磷酸化相關(guān)（圖4H），提示其激活。與此同時(shí)，向ECs中添加cGAS酶活性的產(chǎn)物cGAMP，會(huì)輕微但不顯著地提高Ctr ECs中的p-TBK1和VCAM1，而對(duì)ATG5KO ECs沒(méi)有額外的影響（圖4H）。

        研究者進(jìn)一步探索了自噬可以刺激清除cGAS激活因子的可能性，例如來(lái)自線(xiàn)粒體的胞質(zhì)雙鏈DNA（dsDNA），這是STING信號(hào)通路的一個(gè)已確定的內(nèi)源性觸發(fā)因素。在真正凋亡信號(hào)驅(qū)動(dòng)的線(xiàn)粒體外膜通透化的細(xì)胞中，自噬可以抑制I型IFN。使用TOMM20對(duì)線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行染色的超分辨率顯微鏡檢查和抗dsDNA抗體顯示，與顯示在線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò)內(nèi)包裹的dsDNA的Ctr ec相比，ATG5-KO EC中的dsDNA主要位于線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò)附近，部分位于細(xì)胞質(zhì)中（圖4I），這表明其通過(guò)線(xiàn)粒體源性囊泡流出。雖然與Ctr ECs相比，ECs中的ATG5 KO未引起關(guān)鍵線(xiàn)粒體形態(tài)測(cè)量參數(shù)的明顯變化（圖4J）。此外，鑒于STING含有一個(gè)LC3相互作用區(qū)域，因此可以作為自噬降解的靶點(diǎn)，研究者不能排除這一機(jī)制導(dǎo)致了在ATG5缺失的內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到的STING信號(hào)。盡管如此，這些結(jié)果表明，在內(nèi)皮細(xì)胞中自噬的缺失介導(dǎo)了cGAS-STING和NF-κB的激活，導(dǎo)致了一系列炎癥/免疫調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。同樣，內(nèi)皮細(xì)胞中ATG5的消融，伴隨著VCAM1的上調(diào)，導(dǎo)致了經(jīng)典NF-κB通路的抑制性IκBα蛋白的磷酸化，并增加了替代NF-κB信號(hào)通路的介質(zhì)積累；前體蛋白p100、其降解產(chǎn)物p52和RelB，提示NF-κB通路的激活（圖4K）。

        然后，研究者評(píng)估了在自噬缺失的內(nèi)皮細(xì)胞中，是否需要cGAS-STING來(lái)激活NF-κB。為此，研究者利用CRISPR-Cas9在Ctr和ATG5KO細(xì)胞中刪除了STING。然而，ATG5和STING的伴隨和慢性抑制的效應(yīng)在不同的人類(lèi)EC供體中不同，這使得結(jié)果不可靠。因此，研究者測(cè)試了抑制ULK1/2在STING去除細(xì)胞中的作用。與ATG5KO類(lèi)似，抑制ULK1/總之，這些數(shù)據(jù)假設(shè)STING促進(jìn)了NF-κb依賴(lài)的免疫支持Atg5BECKO表型的加重，但不是必需的。

圖4 在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，自噬通過(guò)清除胞質(zhì)內(nèi)的雙鏈DNA，通過(guò)CGAS-STING-介導(dǎo)的NF-κB通路抑制炎癥反應(yīng)

4. 腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞自噬限制黑色素瘤對(duì)抗PD1治療的反應(yīng)

        鑒于阻斷自噬具有免疫刺激作用，同時(shí)CD8 T細(xì)胞浸潤(rùn)和活性增強(qiáng)，因此研究者研究了破壞TEC中的自噬可否通過(guò)免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）的形式促進(jìn)免疫治療（圖6A）。雖然抗PD1單藥治療顯著降低了WT小鼠中的B16-F10腫瘤生長(zhǎng)，但免疫治療對(duì)攜帶B16-F10的Atg5BECKO小鼠的效果是遞增的，但不顯著（圖6B，C）。這些結(jié)果提示，在攜帶黑色素瘤小鼠的TEC中，阻斷自噬有利于TILs的募集和活性（圖2D-G），因此并未進(jìn)一步增強(qiáng)抗PD1 ICB治療的療效，但可能進(jìn)一步維持其療效。

        研究者之前的分析特別表明，treatment-na?ve癌癥患者的huTEC干擾素亞型在muTEC-DE High和自噬low基因標(biāo)簽的表達(dá)之間表現(xiàn)出不同的關(guān)聯(lián)（圖3F）。為了進(jìn)一步闡明這些TEC特異性標(biāo)簽的意義，以及它們與黑色素瘤患者對(duì)ICBs的臨床應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)，研究者隨后使用來(lái)自一項(xiàng)獨(dú)特的前瞻性縱向研究的scRNAseq數(shù)據(jù)研究了huTEC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。在治療前和第一個(gè)治療周期后收集腫瘤活檢組織并進(jìn)行scRNAseq分析。

        數(shù)據(jù)包括來(lái)自22個(gè)樣本的TEC，N=12有反應(yīng)（R），N=10無(wú)反應(yīng)（NR）（圖6D）。總體而言，研究者使用已建立的無(wú)偏倚EC識(shí)別方法對(duì)1541個(gè)EC進(jìn)行了注釋。與無(wú)應(yīng)答者相比，應(yīng)答者的huTEC在治療前顯著富集了核心炎癥基因集（圖6E），而自噬基因核心標(biāo)簽的富集較低。有趣的是，無(wú)應(yīng)答者在一個(gè)治療周期后也顯示出muTEC-DE標(biāo)簽的富集（圖6E）。這可能提示TEC炎癥表型與TME的初始變化相關(guān)，這一變化是由抗PD1的首次應(yīng)答驅(qū)動(dòng)。然而，在同一組患者中，較高的自噬評(píng)分無(wú)變化（圖6E），這提示只有muTEC High / autophagy Low狀態(tài)與臨床獲益相關(guān)。

        然后，研究者研究了應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者之間的muTEC-DE標(biāo)簽是否僅在huTECs亞型中存在差異。為此，研究者將所有huTECs聚類(lèi)，并獲得了11種亞型，這些亞型反映了在原發(fā)泛癌數(shù)據(jù)中觀察到的huTECs異質(zhì)性。與無(wú)應(yīng)答的黑色素瘤患者相比，對(duì)抗PD1有應(yīng)答的黑色素瘤患者在干擾素、Tip/Stalk和靜脈EC簇中有顯著富集的muTEC-DE特征，這一趨勢(shì)在干擾素亞型的ON治療時(shí)間點(diǎn)穩(wěn)定維持。值得注意的是，應(yīng)答者中的這些相同簇在ON治療時(shí)間點(diǎn)顯示自噬標(biāo)記的表達(dá)顯著降低（圖6F）。此外，利用這些scRNAseq數(shù)據(jù)集，研究者發(fā)現(xiàn)所有TECs中的muTEC-DE標(biāo)簽表達(dá)水平與CD8+T細(xì)胞的瘤內(nèi)浸潤(rùn)呈正相關(guān)（圖6G）。

        總之，這些數(shù)據(jù)提示，muTEC-DE High/自噬低表型在臨床上與抗PD1治療的良好應(yīng)答相關(guān)。

圖5 TECs中Sting和Atg5的雙重基因缺失促進(jìn)了替代NF-κB通路的激活

5. 炎癥血管和CD8+ T細(xì)胞的空間接近與抗PD1治療的反應(yīng)相關(guān)

        然后，研究者試圖描述炎癥huTEC與黑色素瘤樣本中CD8+T細(xì)胞和VCAM1或VCAM1/STING蛋白表達(dá)增強(qiáng)的空間關(guān)系。研究者采用多重迭代標(biāo)記抗體新沉積技術(shù)進(jìn)行了多重免疫組織化學(xué)，研究者使用了接受抗PD1單藥治療的黑色素瘤患者的一組真實(shí)生活活檢。黑色素瘤活檢組包括6例有反應(yīng)者和6例無(wú)反應(yīng)者。研究者在活檢的三個(gè)不同空間區(qū)室（即腫瘤區(qū)、腫瘤-間質(zhì)界面和非腫瘤區(qū)域）評(píng)估了CD31/AQP1雙陽(yáng)性（識(shí)別huTECs）、CD8+ PD1-GrzB-T細(xì)胞（識(shí)別na?ve CD8+ T細(xì)胞）和CD8+ PD1+GrzB+（識(shí)別活化/效應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞）。在腫瘤體積和腫瘤-間質(zhì)界面，無(wú)反應(yīng)和有反應(yīng)的EC數(shù)量沒(méi)有差異（圖7A，B）。然后，研究者通過(guò)鄰域分析研究了這些細(xì)胞類(lèi)型在這些空間區(qū)室中的鄰近性。與無(wú)應(yīng)答患者相比，緩解患者的VCAM1+和VCAM1+STING+TECs分別在腫瘤區(qū)域和腫瘤-間質(zhì)界面顯著富集（圖7C，D）。進(jìn)一步的鄰域分析表明，在CD8+ PD1-GrZB-和CD8+ PD1+GrZB+T細(xì)胞附近，緩解患者的VCAM1+STING+TECs數(shù)量顯著較高（圖7E，F）。在腫瘤-間質(zhì)界面和腫瘤區(qū)域，這一觀察結(jié)果是正確的。尤其是在腫瘤體積內(nèi)，即使數(shù)量較低，VCAM1+血管仍然顯著接近CD8+ T細(xì)胞的兩個(gè)亞群，這提示即使在沒(méi)有STING的情況下，炎癥血管表型與浸潤(rùn)的TILs保持更良好的交互作用（圖7G，H）。研究者也在MILAN分析中使用了LC3抗體，但由于TECs中LC3染色的細(xì)胞內(nèi)顆粒狀和彌散型的分辨率有限，研究者無(wú)法可靠地評(píng)估其相關(guān)的自噬狀態(tài)。

        總之，這些結(jié)果表明，炎癥血管與浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞之間的空間接近是黑色素瘤患者對(duì)抗PD1治療產(chǎn)生應(yīng)答的TME的標(biāo)志。

圖6 黑色素瘤中TEC‐自噬與抗‐PD1治療的反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)

結(jié)論：

        該研究提高了對(duì)自噬作為血管固有的抗炎/免疫抑制機(jī)制的作用的認(rèn)識(shí)，限制了黑色素瘤的抗腫瘤免疫。該研究還為利用血管歸巢工具確定針對(duì)腫瘤血管的自噬抑制劑或NF-κB調(diào)節(jié)劑的適當(dāng)聯(lián)合治療提供了理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法：

        細(xì)胞培養(yǎng)，小鼠實(shí)驗(yàn)，免疫表型分析，免疫熒光成像，RNA分離，定量RT-PCR，蛋白質(zhì)印跡，單細(xì)胞RNA測(cè)序

參考文獻(xiàn)：

        Verhoeven J, Jacobs KA, Rizzollo F, Lodi F, Hua Y, Po?niak J, et al. Tumor endothelial cell autophagy is a key vascular-immune checkpoint in melanoma. EMBO Mol Med. 2023 Nov 27:e18028. doi: 10.15252/emmm.202318028.