功能性Tregs在腫瘤發生和進展中發揮關鍵作用，是抗癌免疫的主要障礙。 Tregs 在癌癥中的產生機制以及腫瘤微環境對這些過程的影響仍不完全清楚。在這里，作者通過使用核磁共振、化學酶結構測定和大量的體外和體內功能分析，證明腫瘤碳水化合物 A10 (Ca10) 是一種源自埃立克氏腫瘤 (ET) 細胞的細胞表面碳水化合物，是一種硫酸乙酰肝素相關蛋白多糖，可增強糖酵解并促進人類樹突狀細胞（DCs）中耐受性特征的發展。Ca10 刺激的人類 DCs 通過部分依賴于代謝重編程、PD-L1、IL-10 和 IDO機制產生高度抑制性 Tregs。 Ca10 還可以將人類單核細胞重新編程為具有耐受性特征的DCs。在實體 ET 小鼠中，作者發現 Ca10 血清水平、腫瘤大小和脾 Treg 數量之間呈正相關。給予分離的 Ca10 還可增加無腫瘤小鼠脾臟 Tregs 的比例。值得注意的是，作者提供的證據支持循環人類 Ca10 對應物 (Ca10H) 的存在，并首次表明，與健康個體相比，患不同癌癥類型的患者血清 Ca10H 水平升高。值得注意的是，具有骨轉移的前列腺癌患者的Ca10H水平高于沒有骨轉移的前列腺癌患者。總的來說，該研究揭示了與腫瘤細胞相關的硫酸乙酰肝素相關結構促進癌癥中功能性 Tregs 生成的新分子機制。這種新穎的結構-功能關系的發現可能開辟新的研究途徑，對癌癥治療具有重要的臨床意義。該研究于2023年11月發表在《Cellular & Molecular Immunology》，IF 24.1分。

技術路線：

主要研究結果：

1 血清Ca10水平與ET小鼠的腫瘤大小和脾臟Treg數量呈正相關

為評估循環Ca10水平、腫瘤大小和Treg生成之間的潛在關系，作者使用了攜帶固體ET的小鼠（圖1A）。在血清Ca10水平和腫瘤大小之間觀察到強烈的正相關性（圖1B）。脾臟FOXP3+ Tregs比例也與血清Ca10水平和腫瘤大小呈中度但顯著的正相關（圖1C）。由于不同攜帶ET的小鼠之間腫瘤大小的可變性，以246 mm3為臨界點（平均腫瘤大小），對攜帶大（>246 mm3）和小（<246 mm3）腫瘤的小鼠進行分層。脾臟FOXP3+ Tregs的百分比在攜帶大腫瘤的小鼠中顯著高于攜帶小腫瘤的小鼠，無論腫瘤接種后經過的時間如何，始終高于對照小鼠（圖1D）。在攜帶大腫瘤（>246 mm3）的小鼠中，在早期時間點（腫瘤接種后24天）發生的脾臟Tregs的百分比顯著高于在后期時間點（從接種ET細胞后48天起）達到該大小的大腫瘤（圖1E）。這些數據表明血清Ca10水平、脾臟Tregs的誘導和腫瘤進展之間存在密切關系。為進一步研究Ca10是否可能直接參與觀察到的Treg數量的增加，將分離的Ca10單獨或與mAb A10聯合給藥于C57BL/6J無腫瘤小鼠（圖1F）。值得注意的是，與對照小鼠相比，在給予Ca10的小鼠中脾臟FOXP3+ Tregs的百分比顯著更高，這是在Ca10給藥9天后觀察到的（圖1G）。值得注意的是，在這些實驗中，觀察到血清Ca10水平與脾臟Tregs的百分比之間存在顯著的正相關性（圖1H）。Ca10與mAb A10聯合給藥以劑量依賴性方式顯著損害了由Ca10給藥誘導的脾臟Treg的產生，表明mAb A100完全阻斷了Ca10的Treg誘導能力（圖1I）。總之，這些結果表明，ET脫落的Ca10可能促進Tregs的產生，而Tregs反過來可能有利于腫瘤的進展。

圖1：攜帶埃立克氏腫瘤（ET）的小鼠中Tregs百分比增加

2 Ca10賦予人類DCs耐受性特征

        為進一步探索Ca10促進Treg生成的潛在能力的機制，作者首先研究了腫瘤相關碳水化合物調節人類DC表型和功能的能力。從健康供體的人血單核細胞分化的Ca10刺激DC（圖2A）顯著上調HLA-DR、CD86/CD83和耐受性標志物PD-L1的表達（圖2B）。Ca10刺激的DC也比未刺激的細胞產生顯著更高水平的TNF-α、IL-6、IL-1β和抗炎細胞因子IL-10（圖2C）。動力學實驗表明，Ca10以時間依賴性的方式快速增加促炎細胞因子的mRNA水平，在刺激24小時后降至幾乎基本水平（圖2D）。相反，IL-10的mRNA水平（圖2D）和致耐受分子PD-L1、IDO、SOCS1和SOCS3（圖2E）在刺激24小時后保持升高，表明Ca10可能賦予人DC耐受性特征。支持這些數據的是，阻斷IL-10顯著增強了促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產生，而用IDO活性的選擇性抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）治療顯著降低了Ca10刺激的DC中IL-10的產生（圖2F）。阻斷IL-10或IDO也降低了Ca10刺激的DC中的PD-L1水平（圖2G），表明Ca10賦予的人類DC的耐受性特征部分依賴于IL-10和IDO誘導。

圖2：Ca10誘導耐受性人DC

3 Ca10激活免疫通路并增強人DCs的糖酵解

        為進一步深入了解Ca10在人類DC中作用模式的分子機制，作者評估了其激活經典免疫途徑和促進代謝重組的能力。Ca10誘導絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）（細胞外信號調節激酶（ERK）、p38和c-Jun N-末端激酶（JNK））和核因子-κB（NF-κB）的快速激活，這通過所測定的MAPKs和IκBα的磷酸化形式的增加來確定（圖3A）。ERK、p38和IκBα的總水平沒有變化，只觀察到JNK的總水平增加（圖3A）。支持這些數據的是，藥理學抑制劑U0126（對MEK 1/2特異性，ERK上游）、SB202190（對p38特異性）、SP600125（對JNK特異性）和BAY117082（對NF-κB特異性）顯著抑制了Ca10激活的人DC中IL-6和IL-10的產生（圖3B）。當DC與EDTA（鈣的螯合劑）和piceatannol（脾臟酪氨酸激酶（Syk）抑制劑）預孵育時，由Ca10刺激誘導的IL-6和IL-10的產生顯著受損（圖3B）。這些抑制數據表明，盡管Ca10可能靶向人類DC中的其他受體，如Syk偶聯的C型凝集素受體（CLRs），但MAPKs和NF-κB的激活似乎是誘導細胞因子信號的主要驅動因素。

        接下來，作者研究了Ca10促進人類DC代謝重編程的能力。使用海馬生物分析儀進行實時細胞外酸化率（ECAR）、線粒體耗氧率（OCR）和糖酵解質子流出率（glycoPER）動態實驗。與未刺激的細胞相比，Ca10刺激的人DC中基礎糖酵解和補償糖酵解顯著增加（圖3C）。在Ca10刺激的DC和未刺激的DC之間，沒有觀察到基礎呼吸、最大呼吸、ATP產生耦合呼吸或備用呼吸能力的顯著變化。支持這些數據的是，與未刺激的細胞相比，Ca10顯著增加了培養基中葡萄糖的消耗和DC的代謝率（圖3D）。因此，在細胞培養上清中，Ca10激活的人DC顯示出比對照細胞顯著更高的瓦爾堡效應和乳酸產生（圖3E和F）。總之，這些數據表明，Ca10在不影響人DC線粒體氧化磷酸化的情況下增強了糖酵解和乳酸發酵。為進一步分析mTOR介導的信號通路和糖酵解對Ca10在人DC中發揮耐受特性的貢獻，作者進行了抑制實驗。在Ca10激活的DC中，雷帕霉素和2-脫氧葡萄糖（2-DG）對mTOR途徑的抑制顯著抑制了促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β以及IL-10的產生，而在2-DG存在的情況下，觀察到TNF-α的產生顯著增加（圖3G）。因此，mTOR和糖酵解的抑制顯著降低了Ca10誘導的人DC中PD-L1的表達水平（圖3H），表明mTOR介導的信號通路和糖酵代謝有助于Ca10賦予人DC的耐受特性。

圖3：Ca10在人DC中誘導MAPK和NF-κB信號通路和代謝重編程

4 Ca10刺激的耐受性人DCs通過部分依賴于代謝重編程、PD-L1、IL-10 和 IDO 機制產生功能性Tregs

        為確定Ca10是否真的可以產生具有極化功能性Treg能力的人類耐受性DC，作者用同種異體幼稚CD4+ T細胞進行共培養實驗（圖4A）。Ca10刺激的人DC產生的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs的百分比顯著高于未刺激的對照DC（圖4B）。當Ca10預先與阻斷mAb A10孵育時，由Ca10激活的DC誘導的Treg數量顯著減少（圖4C）。值得注意的是，Ca10刺激的DC誘導的Treg是具有功能性，因為與非Treg組相比，它們能夠以劑量依賴性的方式潛在地抑制自體外周血單核細胞（PBMCs）的增殖（圖4D，E）。支持這些發現的是，用Ca10刺激的含有漿細胞樣（pDC）和髓細胞樣（mDC）DC的人血液總DC的富集部分（圖4F）產生的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs百分比也顯著高于未刺激的總DC（圖4G）。阻斷PD-L1、IL-10、IDO、mTOR和糖酵解顯著影響Ca10刺激的DC產生Tregs（圖4H），同時伴有IL-5和IL-10水平顯著降低（圖4I）。阻斷PD-L1、IL-10和IDO誘導了顯著更高水平的IFN-γ，特別是在PD-L1抑制后，其中mTOR和糖酵解的抑制顯著降低了IFN-γ的產生（圖4I）。

圖4：Ca10誘導的耐受性人樹突狀細胞促進功能性調節性T細胞的產生

5 在Ca10存在下分化為DCs的人單核細胞產生具有促進Tregs 能力的耐受性 DCs

        為分析Ca10是否可以重新編程單核細胞分化為DC，在存在或不存在Ca10的情況下，根據常規方案將從健康供體中純化的人單核細胞分化為DCs（圖5A）。與缺乏Ca10的傳統hmoDC相比，Ca10/hmoDC表達的HLA-DR、CD83、CD14以及耐受性標志物PD-L1和ICOSL水平顯著更高（圖5B）。與傳統的hmoDC相比，Ca10/hmoDC顯示耐受基因PDL1、IDO、SOCS1和SOCS3的mRNA表達水平增加，表明存在耐受表型（圖5C）。LPS刺激后，Ca10/hmoDCs產生的促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β以及抗炎細胞因子IL-10的濃度顯著降低（圖5D）。盡管Ca10/hmoDC產生的IL-10較低，但Ca10/hmo DC的TNF-α/IL-10、IL-6/IL-10和IL-1β/IL-10比率顯著低于hmo DC（圖5E）。這些結果表明，在分化過程中，Ca10可能賦予hmoDCs抗炎表型。使用海馬生物分析儀進行的功能代謝實驗顯示，與hmoDC相比，新分化的Ca10/hmoDC的基礎和最大呼吸、ATP產生耦合呼吸和備用呼吸能力顯著降低（圖5F），表明Ca10/hmo DC的線粒體OXPHOS活性較低。值得注意的是，Ca10/hmoDC產生的T細胞產生的IFN-γ濃度明顯低于傳統hmoDC引發的T細胞，而IL-5或IL-10的產生沒有差異（圖5G）。當Ca10/hmoDCs產生T細胞時，IL-10/IFN-γ比率顯著高于傳統hmoDCs產生的T細胞，并且在IL-10/IL-5比率上沒有觀察到差異（圖5H）。Ca10/hmoDCs誘導的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs的百分比明顯高于傳統的hmoDCs（圖5I）支持這些數據。總之，這些結果表明，Ca10還能夠重新編程單核細胞分化為具有抗炎和耐受特征的DC。

圖5：Ca10存在下分化為DC的單核細胞產生具有促進Tregs能力的耐受性人DC

6 Ca10對人類Tregs的產生和擴增沒有直接影響

        為評估Ca10通過直接作用T細胞來調節Treg產生的潛在能力，在存在或不存在Ca10的情況下，根據用于Treg生成的常規方案分化來自健康供體的純化幼稚CD4+ T細胞（圖6A）。在存在Ca10（Ca10/Tregs）的情況下，產生的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs的百分比與根據Treg產生的常規分化方案在沒有Ca10的情況下獲得的百分比沒有顯示出顯著差異（圖6B）。當比較兩種測定條件時，沒有觀察到細胞活力的差異（圖6B）。重要的是，這些生成的Ca10/Tregs和Tregs顯示出相似的功能抑制能力（圖6C）。接下來，為評估Ca10對已經分化的Tregs擴增的潛在直接影響，在先前產生的Tregs再擴增過程中添加了Ca10（圖6D）。再擴增7天后，CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs的百分比相似，細胞活力沒有差異（圖6E）。作者沒有觀察到在含有或不含有Ca10的擴增Treg之間的功能抑制能力的顯著差異（圖6F）。總之，這些結果表明，在所測定的條件下，Ca10對Tregs的分化、活化和存活沒有直接影響。

圖6：Ca10對Treg生成和擴增的直接影響

7 Ca10是一種硫酸乙酰肝素相關的糖胺聚糖，可誘導耐受性DCs和Tregs生成

        Ca10是一種高度糖基化的高分子量結構，mAb A10識別的碳水化合物表位對NaIO4氧化敏感（圖7A），其特異性切割帶有未取代的羥基或氨基的相鄰碳之間的鍵。用NaIO4處理Ca10完全消除了mAb A10的反應性，并導致碳水化合物組分的顯著降解，從而分子大小減小，如NMR擴散有序光譜（DOSY）所觀察到的（圖7A）。為深入了解Ca10中所含的碳水化合物結構，并考慮到Ca10糖類的NMR譜與糖胺聚糖（GAG）一致，作者使用了在不同位置切割聚糖的各種酶。外糖苷酶對Ca10沒有影響，也不影響PNGase-F或O-聚糖酶。在所有測試的酶中，Ca10僅被肝素酶類型的GAG裂解酶降解，表明Ca10的聚糖結構是與硫酸乙酰肝素相關的GAG。用肝素酶II/III處理Ca10（HPSE處理）完全消除了mAb A10的反應性（圖7B），并將碳水化合物組分水解成低分子量片段，如通過擴散NMR觀察到的（圖7B）。同樣，所得到的二糖片段的主要成分在消化時的NMR圖譜與ΔUA-GlcNH2和ΔUA GlcHNHAc的圖譜相匹配，它們與形成硫酸乙酰肝素的二糖有關（圖7C），證實Ca10的主要碳水化合物部分是乙酰肝素型的GAG。支持這些數據的是，ET細胞在硫酸乙酰肝素生物合成的特異性抑制劑存在下的生長顯示出比未處理的細胞顯著更低的Ca10表面表達和更低水平的可溶性Ca10（圖7D）。用NaIO4氧化Ca10（Ca10-OX）、肝素酶處理（HPSE處理）或肝素的存在消除了Ca10介導的IL-10的產生，并顯著損害了人DC中PD-L1的表達（圖7E，F）。類似地，當DC先前用NaIO4氧化、用肝素酶處理或在肝素存在下時，Ca10刺激的DC產生的CD4+CD127-CD25highFOXP3+ Tregs顯著減少（圖7G）。總之，這些結果表明Tregs的產生是由位于Ca10的糖組分中的mAb A10識別表位的存在所介導。

圖7：Ca10碳水化合物結構是硫酸乙酰肝素相關的糖胺聚糖，驅動耐受性DC和Treg誘導

8 與健康對照組相比，不同腺癌患者的血清其人 Ca10 同源物 （Ca10H） 水平更高

        為評估癌癥患者和健康對照中血清人Ca10同源物（Ca10H）的水平，如材料和方法中所述，使用與用于測量小鼠Ca10水平相同的ELISA（圖8A）。對不同類型癌癥患者在疾病任何階段的血清進行了檢測。如圖所示，與健康供體（n=131）相比，前列腺（n=248）、結直腸（n=66）或其他癌癥類型（n=71）患者的Ca10H水平顯著升高（圖8B）。為初步了解癌癥患者中Ca10H水平的潛在臨床相關性，測試了患有（n=42）或未患有（n=30）骨轉移的癌癥前列腺患者的不同血清樣本。如圖8C所示，有骨轉移的癌癥患者Ca10H水平高于無骨轉移的患者。支持這些數據的是，骨轉移患者的血清Ca10H水平與血清堿性磷酸酶水平相關，這是一種公認的骨轉換生物標志物（圖8D）。值得注意的是，用肝素酶處理前列腺癌癥患者的不同血清，但不使用唾液酸酶作為對照，完全消除了這些血清中的Ca10H水平（圖8E），驗證了至少在前列腺癌癥患者血清中人Ca10H與鼠Ca10和硫酸乙酰肝素的關系。

圖8：癌癥患者血清中人Ca10同源物（Ca10H）的水平與健康對照組相比

結論：

         總之，本研究證明了腫瘤相關的硫酸乙酰肝素結構參與了耐受性反應的誘導，從而在腫瘤逃逸和進展中發揮潛在作用。

實驗方法：

         細胞培養，細胞遷移測定，細胞增殖測定，流式細胞術，RNA提取，RT-PCR，Western blot，Treg抑制試驗，細胞因子定量，核磁共振實驗

參考文獻：

        Martín-Cruz L, Vi?uela M, Kalograiaki I, Angelina A, Oquist-Phillips P, Real-Arévalo I, Ca?ada FJ, Tudela JI, Moltó L, Moreno-Sierra J, Subiza JL, Palomares O. A tumor-associated heparan sulfate-related glycosaminoglycan promotes the generation of functional regulatory T cells. Cell Mol Immunol. 2023 Nov 22. doi: 10.1038/s41423-023-01096-9. Epub ahead of print. PMID: 37990034.